小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)Protocol
微生物查詢網(wǎng) / 2015-03-26 12:25:12
小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)Protocol
復(fù)蘇：
1，將小鼠神經(jīng)干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。 ,
2，將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。
3，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。
4，輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
5，按照小鼠神經(jīng)干細(xì)胞說(shuō)明書(shū)中建議復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至一個(gè)T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入培養(yǎng)液6 ml。
6，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
復(fù)蘇第二天觀察，如死細(xì)胞較多，更換新鮮的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)的更好。
傳代：
1，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%滿時(shí)進(jìn)行傳代，一般2-3天，具體視細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
2，吸除廢液。
3，用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4，加入1-2 ml的0.05%胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5，在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要5-15 min）。
6，加2 ml小鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。
7，1000 rpm離心5 min，去上清，加入小鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液2 ml。
8，多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。
9，按照1:4-1:10的比例進(jìn)行傳代。
10，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
凍存：
1，按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液。
2，以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3，按每支凍存管內(nèi)加入500 ml
細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。 ,4，將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
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