一、背景
人肺腺癌細(xì)胞該細(xì)胞是從一名25歲的白人男性肺腺癌患者的胸水中分離建立的；該患者曾使用過環(huán)磷酰胺、博來霉素、阿霉素進(jìn)行治療。該細(xì)胞接種至裸鼠可成瘤；可作轉(zhuǎn)染宿主。
二、人肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇人肺腺癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人肺腺癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將人肺腺癌細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人肺腺癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1、人肺腺癌細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人肺腺癌細(xì)胞可以用于四種穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物在Caco-2和Calu-3單細(xì)胞層模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)研究：
建立了Caco-2和Calu-3單細(xì)胞層模型,觀察四種穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物在單細(xì)胞層模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)過程,預(yù)估藥物在消化道黏膜和呼吸道黏膜的滲透性。實(shí)驗(yàn)逐一建立四種穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物高效液相色譜含量測(cè)定方法,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果表明這些方法適用性好、準(zhǔn)確度高,可用干測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物的含量。
采用四甲基偶氮唑鹽比色法計(jì)算不同濃度穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物作用24小時(shí)后Caco-2細(xì)胞株和Calu-3細(xì)胞株的存活率,比較其對(duì)于兩細(xì)胞株細(xì)胞活性的影響,確定轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)時(shí)的安全給藥濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,四種穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物對(duì)于兩細(xì)胞株的細(xì)胞活性均表現(xiàn)為抑制作用,且具有濃度依賴性;四種穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物對(duì)Caco-2細(xì)胞株細(xì)胞活性的抑制較Calu-3細(xì)胞株更大;在給定濃度范圍內(nèi),四種穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物安全性由大至小依次為穿心蓮內(nèi)酯總磺化物、亞硫酸氫鈉穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯鉀鈉鹽、脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽;當(dāng)濃度低于500μg·L-1時(shí),四種穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物作用于兩細(xì)胞株,其存活率均接近甚至高于90%,即0-500μg·mL-1為轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)時(shí)的安全給藥濃度。實(shí)驗(yàn)成功建立Caco-2和Calu-3單細(xì)胞層模型,考察給藥濃度、作用時(shí)間及P-糖蛋白抑制劑對(duì)穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
結(jié)果表明,四種穿心蓮內(nèi)酯水溶性衍生物在Caco-2單細(xì)胞層模型上雙側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)均具有濃度依賴性,轉(zhuǎn)運(yùn)量隨給藥濃度升高而增大;穿心蓮內(nèi)酯總磺化物和脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯鉀鈉鹽在Calu-3單細(xì)胞層模型上表觀滲透系數(shù)值較大,呼吸道黏膜滲透性更高,更適合于肺部吸入制劑的開發(fā),亞硫酸氫鈉穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽在Caco-2單細(xì)胞層模型上表觀滲透系數(shù)值較大,消化道黏膜滲透性更高,更適合于口服給藥制劑的開發(fā);添加P-糖蛋白抑制劑后,脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯鉀鈉鹽在Calu-3單細(xì)胞層模型上的外排比及亞硫酸氫鈉穿心蓮內(nèi)酯在Caco-2單細(xì)胞層模型上的外排比均顯著降低,即P-糖蛋白參與二者轉(zhuǎn)運(yùn)過程,故聯(lián)合應(yīng)用P-糖蛋白抑制劑可以減少外排,促進(jìn)吸收,增加滲透性。
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