一、背景
大鼠肝上皮樣干細胞是成年Fischer 344大鼠正常肝上皮細胞系，呈單層生長，種群倍增在開始時為20-23小時，但在12.5小時后增加。
二、大鼠肝上皮樣干細胞培養(yǎng)條件
1、大鼠肝上皮樣干細胞培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基（不含Hepes）+10%胎牛血清+1%雙抗+800ng/ml Taxol
2、溫度：37.0°C
3、氣體:空氣95%，CO2 5%
三、大鼠肝上皮樣干細胞培養(yǎng)步驟
（1）復蘇大鼠肝上皮樣干細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
（2）大鼠肝上皮樣干細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a）、對于大鼠肝上皮樣干細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗大鼠肝上皮樣干細胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打大鼠肝上皮樣干細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將JeKo-1細胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
（3）大鼠肝上皮樣干細胞凍存：
1、大鼠肝上皮樣干細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待大鼠肝上皮樣干細胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3、用適量的凍存液重懸大鼠肝上皮樣干細胞，并放置于凍存管中；
4、先將大鼠肝上皮樣干細胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃。
四、應用
大鼠肝上皮樣干細胞可以用于體外誘導BMP7基因修飾的大鼠骨髓間充質干細胞向腎小管上皮樣細胞分化的實驗研究：
觀察體外腎小管上皮細胞(Normal Rat Kidney Epithelial Cells)缺氧復氧損傷(Hypoxia-reoxygenation,H/R)微環(huán)境下慢病毒介導的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(human Bone Morphogenetic Protein-7,hBMP-7)轉染對大鼠骨髓間充質干細胞(Rat Bone Mesenchymal Stem Cells,rBMSCs)向腎小管樣上皮細胞分化的影響,初步探討以BMSCs作為hBMP-7基因運載細胞,hBMP-7和rMSCs聯(lián)合修復缺氧再灌注急性腎臟損傷的可行性。
方法：
1、貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠BMSCs,經CD29、CD34、CD44、CD45鑒定BMSCs,并繪制不同代數(shù)細胞生長曲線和貼壁率曲線分析其生物學特性。選取生物活性良好的第三代(P3)、四代(P4)BMSCs作為轉染BMP7載體細胞；
2、構建編碼綠色熒光蛋白(GFP)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7慢病毒載體(Lv-hBMP-7-GFP),體外轉染BMSCs后,MTT、Brdu標記及流式細胞分析Lv-hBMP-7-GFP轉染對BMSCs生物活性的影響；
3、構建大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)的缺氧復氧(H/R)模型,經流式細胞分析檢測H/R后細胞凋亡情況,并在Transwell培養(yǎng)體系中與rMSCs共培養(yǎng),分別于共培養(yǎng)后第3d、5d、7d收集細胞,經RT-PCR檢測誘導后細胞E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達,并經免疫組化染色及流式細胞儀測定第18型細胞角蛋白(Cytokeratin18,CK-18)的陽性表達率。
結果：
1、貼壁法可以簡便提取原代BMSCs并進行體外擴增培養(yǎng)予以純化；
2、構建的Lv-hBMP-7-GFP可以高效轉染rMSCs,轉染效率約為70%,轉染后的rMSCs增殖活性無明顯改變(0.322±0.022,0.302±0.017,0.319±0.031,0.311±0.029)(P<0.05)并可以持續(xù)穩(wěn)定的分泌hBMP-7(5d后為0.329±0.043)；
3、H/R NRK-52E與各組rMSCs隨共培養(yǎng)時間的延長E-cadherin和CK-18表達增加(37.22±0.21,36.54±0.32,38.37±0.38,47.02±0.31),與單純rMSCs培養(yǎng)組(2.43±0.18)、NRK-52E與rMSCs共培養(yǎng)組(8.52±0.27)、NRK-52E與轉染Lv-BMP-7的rMSCs共培養(yǎng)組(8.65±0.22)比較存在顯著性差異(P<0.01);H/R NRK-52E與轉染Lv-BMP-7的rMSCs共培養(yǎng)組(47.02±0.31)與其他實驗組(H/R NRK-52E與rMSCs共培養(yǎng)組、H/R NRK-52E與轉染空病毒的rMSCs共培養(yǎng)組、H/R NRK-52E與BMP-7因子作用下的rMSCs共培養(yǎng)組)相比存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
結論：體外大鼠腎小管上皮細胞缺氧復氧微環(huán)境下rMSCs可以有效向腎小管上皮樣細胞分化,并且hBMP-7轉染可以促進rMSCs的定向分化。研究結果可能為hBMP-7和BMSCs聯(lián)合改善急性缺血再灌注所致的腎臟損傷提供新的研究方法。
北京百歐博偉生物技術有限公司的微生物菌種查詢網提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務,是中國微生物菌種保藏中心的服務平臺，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網站，自設設備及技術的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！