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1、DAB 顯色時(shí)間如何把握？
1)、DAB 顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；
2)、DAB 顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；
3)、此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；
4)、DAB 顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗 4 度過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
2、免疫組化結(jié)果如何分析？
1)、陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法:在 40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的 10 個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組 3~6 張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。
2)、灰密度分析法:通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j 進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。
3)、評(píng)分法:通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度(0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色)、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分(1~4 分為0~25%,26~50%,51~75%,76~100%)，最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。
Tips：對(duì) 2 中的這幾種方法，各有利弊，請(qǐng)細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。
3、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？
1)、由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。
2)、修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高 pH 的等）。
3)、微波修復(fù)，我們一般用 6 min*4 次，效果不錯(cuò)。
4、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？
1)、一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右；而0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般10~30min。
2)、用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片.
3)、現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。
5、石蠟切片和冰凍切片的比較？
1)、要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。
2)、冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。
缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒(méi)石蠟的漂亮。當(dāng)你買(mǎi)一抗時(shí)，目錄上都寫(xiě)著做什么樣的切片，如果它寫(xiě)著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫(xiě)著兩者都可，那就都能做。
3)、石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來(lái)做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。
由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。
6、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？
1)、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。
單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。
在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過(guò)封閉等避免）。
2)、應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。
3)、種屬反應(yīng)性的選擇（species reactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。
4)、種屬來(lái)源，一般兔來(lái)源的多是多克隆；而小鼠來(lái)源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來(lái)源來(lái)選擇相應(yīng)的二抗。
5)、生產(chǎn)廠家的選擇。
7、產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？
1)、抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。
2)、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。
3)、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；
4)、非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；
5)、DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；
6)、PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要；
7)、標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。
8、免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？
1)、抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。
2)、抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；
建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。
3)、組織切片本身這種抗原含量低；
4)、血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
5)、DAB孵育時(shí)間過(guò)短。
6)、細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。
7)、開(kāi)始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。