種屬
其它細(xì)胞系/倉鼠、猴、豬、狗、雞、鴨等
詳情描述
細(xì)胞介紹
貼壁生長及懸浮生長均可（用于蛋白表達(dá)時，應(yīng)使用懸浮生長狀態(tài)，此時細(xì)胞生長狀態(tài)更好，比表面積更高，生物反應(yīng)器中的傳質(zhì)、傳熱效率更高，同時也可提高生物反應(yīng)器空間使用效率。工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)單抗，重組蛋白，大部分使用懸浮培養(yǎng)法來生產(chǎn)）
細(xì)胞特性
1）來源：中國倉鼠
2）形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣
3）含量：>1x10e6 個/mL
4）污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測為陰性
5）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
運(yùn)輸和保存：可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式：（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇；（2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達(dá)到細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，再進(jìn)行凍存。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
細(xì)胞用途：僅供科研使用。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）培養(yǎng)基信息：EX-CELL CD-CHO CHO Serum-free Medium,Chemically Defined(Sigma-Aldrich,貨號：24361C)
添加物：
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich,貨號：G8540-25G）
Anti-Clumping Agent(Gibco，貨號：01-0057AE)
備注：CD-CHO CHO Serum-free Medium請按照培養(yǎng)基配制說明書配制，L-谷氨酰胺配制濃度為200mM，工作濃度為8mM（即稀釋25倍，如500ml CHO Serum-free Medium 中添加20ml 200mM L-谷氨酰胺，抗結(jié)團(tuán)劑使用為1%，即500ml CHO Serum-free Medium 中添加5ml 抗結(jié)團(tuán)劑）
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
二．細(xì)胞處理：
傳代、轉(zhuǎn)染、建庫及實驗室規(guī)模小試方法：
CHO-S細(xì)胞為已馴化的細(xì)胞，具有良好的適應(yīng)懸浮生長及適應(yīng)無血清培養(yǎng)基生長特性。
傳代方法：
1.10cm皿中培養(yǎng)：使用計數(shù)器（計數(shù)器或者血球計數(shù)板計數(shù)）計數(shù)，接種密度為3×105個細(xì)胞/ml接種于提前37℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基中（建議培養(yǎng)基取7-8ml，此時細(xì)胞生長狀態(tài)較好），置于搖床上生長，轉(zhuǎn)速為120-130rpm，濕度為70-80%，5%二氧化碳，溫度為37℃。
2.培養(yǎng)約2-3天，細(xì)胞密度達(dá)到1×106個活細(xì)胞/ml時，應(yīng)1000rpm，25℃離心5min，離心后計數(shù)（此時應(yīng)稀釋），然后接種密度為3×105個細(xì)胞/ml接種于提前37℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基中。細(xì)胞數(shù)目足夠時，可凍存。
也可選擇125ml或者250ml搖瓶中培養(yǎng)細(xì)胞。（注意細(xì)胞培養(yǎng)液體積一般在總體積的五分之一，如在125ml搖瓶中加入25ml培養(yǎng)物，應(yīng)注意在搖瓶中培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)將瓶蓋稍微擰松，以便于氣體交換，同時也不宜擰得過松，防止細(xì)胞污染）
轉(zhuǎn)染方法：
在連續(xù)5代細(xì)胞密度未超過2×106個活細(xì)胞/ml時，可以使用FreeStyle Max轉(zhuǎn)染試劑（Gibco，貨號：16447）在CD CHO Serum-free Medium中直接轉(zhuǎn)染。（注意：Anti-Clumping Agent會干擾FreeStyle Max轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率，同時也會干擾其他脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率）
建庫方法：
若需要建庫，可將細(xì)胞接種于125ml搖瓶中（接種密度為3×105個細(xì)胞/ml，總體積為25ml），此方法同樣適用于穩(wěn)定表達(dá)所需要蛋白的細(xì)胞株的建庫工作。建庫時，需要先建初級庫（master bank）（一般為10支，每支細(xì)胞總數(shù)不少于4.5×107個細(xì)胞），此步驟結(jié)束后，從凍存的初級庫中取出一支復(fù)蘇，按照同樣步驟建次級庫（working bank）（相同的，一般為10支，每支細(xì)胞總數(shù)不少于4.5×107個細(xì)胞）。
實驗室規(guī)模小試方法：
將挑選出的穩(wěn)定細(xì)胞株從96孔板到24孔板到6孔板到10cm皿中逐級擴(kuò)大培養(yǎng)后（此時需要注意在培養(yǎng)過程中應(yīng)及時保種，以防止后續(xù)步驟出現(xiàn)污染，及應(yīng)對可能的表達(dá)量衰退現(xiàn)象）以3×105個細(xì)胞/ml接種于125ml搖瓶中，轉(zhuǎn)速為120-130rpm，溫度為37℃，濕度為70-80%，連續(xù)培養(yǎng)一周，每天取樣做出相應(yīng)的細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞活率曲線，蛋白表達(dá)曲線，可根據(jù)實際情況，每天取樣測出培養(yǎng)基中葡萄糖含量，以便決定是否需要補(bǔ)加葡萄糖，同時可使用CHO Feed Bioreactor Supplement作為細(xì)胞發(fā)酵中補(bǔ)料，同時做出相應(yīng)的細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞活率曲線，蛋白表達(dá)曲線，為中試放大補(bǔ)料添加做出合理數(shù)據(jù)支持。
