Growth Properties（生長特性）:貼壁
Organism（生物體）: 人
Source（來源）: 膽管癌
Culturing:（培養(yǎng)）Complete growth medium:DMEM，90%；FBS，10%；雙抗。
Temperature: 37.0℃
Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%
Subculturing:（傳代）Protocol:
1.Remove and discard culture medium.
2.Briefly rinse the cell layer with PBS solution to remove all traces of serum that contains trypsin inhibitor.
3.Add 1.0 ml of 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed（about 3-5 min）.
4.Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.
5.Add 6.0 to 8.0 ml of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.
6.Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.
7.Incubate cultures at 37°C.
Subcultivation ratio: A subcultivation ratio of 1:2 to 1:4 is recommended
Medium renewal: 2 times per week
Preservation:(凍存)Freeze medium: FBS/NBS, 92%; DMSO, 8%
Storage temperature: liquid nitrogen vapor phase
三、常見問題及解決方案:
1、 細(xì)胞漂?。号囵B(yǎng)瓶不開封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。次日觀察，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底，表明細(xì)胞活力正常，剩余漂浮的細(xì)胞可以離心去掉，留10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察，細(xì)胞生長至匯合度80%，進(jìn)行消化傳代；如細(xì)胞還是不貼壁，將細(xì)胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察。
2、對(duì)于生長緩慢的貼壁細(xì)胞：可采用適當(dāng)?shù)奶岣吲囵B(yǎng)基中血清濃度，或隔數(shù)日換液的方法來保證細(xì)胞的狀態(tài)和生長速度。
3、對(duì)于生長不均的貼壁細(xì)胞：在培養(yǎng)過程中若出現(xiàn)細(xì)胞分布明顯不均時(shí)（即某一區(qū)域細(xì)胞已重疊生長，而旁邊則為一塊空白），此時(shí)可將細(xì)胞進(jìn)行消化，重新打散，貼壁，加入新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
4、使用不同胰酶的消化時(shí)間相差較大，總體以細(xì)胞收縮變圓并成片脫落為準(zhǔn)終止消化。胰酶活力較強(qiáng)的時(shí)候需要使用5-6倍胰酶體積的完全培養(yǎng)基終止，且終止后離心棄上清后，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞接種。
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