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平臺編號：bio-139086
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細(xì)胞信息： BG01V
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規(guī)格：1×10?cells/T25培養(yǎng)瓶
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服務(wù)費(fèi)用：
加載中…… - 訂購
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注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
人胚胎干細(xì)胞
細(xì)胞描述
BG01V是一株具有異常核型的人類胚胎干細(xì)胞系。盡管有異常的核型（49, XXY, +12, +17），但當(dāng)在小鼠胚胎飼養(yǎng)層（MEFs）上生長時，這些克隆狀仍顯示出均勻的形態(tài)，可預(yù)測生長速率，并且在培養(yǎng)中易于維持。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞的多能性標(biāo)記和堿性磷酸酶活性呈陽性。目前代數(shù)為P23左右，我?guī)焓褂玫娘曫B(yǎng)層為CF-1 MEF ( SCSP-105C 、 SCSP-105R 或 SCSP-110R )
細(xì)胞特性
1） 來源：人 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)
2） 形態(tài)：球形克隆 貼壁生長
3） 含量：>1x10^6 細(xì)胞數(shù)
4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
5） 用途：僅供科研使用
運(yùn)輸和保存
干冰運(yùn)輸：1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備
1）準(zhǔn)備DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 77 %（389mL）
Knockout Serum Replacement （Invitrogen, 10828） 20%（100mL）
GlutaMAX-1谷氨酰胺 1%（5mL）
MEM NEAA非必需氨基酸 1%（5mL）
55mM β-巰基乙醇 1.25mL
bFGF生長因子 4ng/mL（2.0μg）
注意：
1、建議使用CF-1 MEF 作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。
2、在鋪BG01V人胚胎干細(xì)胞前，需對MEF進(jìn)行處理，具體處理步驟見下文絲裂霉素滅活MEF。
3、該細(xì)胞建議凍存干冰發(fā)貨，不適合長時間活細(xì)胞運(yùn)輸，會影響細(xì)胞活力。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：完全培養(yǎng)液 20%%，F(xiàn)BS 60%%，DMSO 20%%現(xiàn)用現(xiàn)配。
我?guī)靸龃鏁r，體積為 500 μl，預(yù)期存活率 70%，每支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇，3 至4 天后，會形成 30 至 40 個克隆，建議復(fù)蘇至 1 個 T25 培養(yǎng)瓶中。
二：細(xì)胞處理
絲裂霉素滅活MEF
待MEF細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，加入含絲裂霉素（15μg/mL）的MEF完全培養(yǎng)液，置于37培養(yǎng)箱中孵育2.5h，2.5h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗1-2遍，加入MEF培養(yǎng)基，備用，當(dāng)天2h后或者第二天可以傳入BG01V人胚胎干細(xì)胞。
復(fù)蘇：
1.將BG01V人胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml BG01V人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的BG01V人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。
4. 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉(zhuǎn)移至1個已經(jīng)鋪好MEF細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
6. 每天更換BG01V人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。
傳代：
1.一般在復(fù)蘇后第 2-3天傳代，視克隆大小和密度而定。
2. 吸除廢液。
3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。
6. 加 2 ml BG01V人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。
7. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。
8. 加入約1ml BG01V人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細(xì)胞， 制成單細(xì)胞懸液。
9. 加入足量的BG01V人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。傳代周期：5-7天，傳代比例：1:3-1:4，每天換液。
凍存：
1.按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。
2. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3.按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4.將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
BG01V人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 20%，F(xiàn)BS 60%，DMSO 20%
附：BG01V人胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：
1.培養(yǎng)中的BG01V人胚胎干細(xì)胞，按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后，加入適量的提前復(fù)溫好的BG01V人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到無 MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的BG01V人胚胎干細(xì)胞，在一個 10 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過快無法有效分離BG01V人胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞）中。
2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時。
3. 1小時后，絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分BG01V人胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
