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細(xì)胞介紹

注：本培養(yǎng)基是不直接添加氟尿嘧啶藥物的。

細(xì)胞特性
1） 來源：結(jié)直腸腺癌
2） 形態(tài)：上皮樣   貼壁生長
3） 含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)
4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
5） 用途：僅供科研使用。
運輸和保存
干冰運輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞
（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
細(xì)胞接收后的處理
1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。
2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。
3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收。
4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。                      

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
（1）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
（2）完全培養(yǎng)基的配制：
①準(zhǔn)備F12K培養(yǎng)基：優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%；補(bǔ)充F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基至所需體積。
②準(zhǔn)備F12K含5-Fu完全培養(yǎng)基：優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%；5-Fu：400~1065uM；補(bǔ)充F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基至所需體積。
（3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：
① 細(xì)胞在傳代和剛復(fù)蘇時較為脆弱，中止液須為不含5-Fu的完全培養(yǎng)基，且在細(xì)胞未貼壁期間和貼壁前期需用不含5-Fu的完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定時再根據(jù)需要濃度添加5-Fu。
②若細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢時，可適當(dāng)降低5-Fu的濃度，或使用不含5-Fu的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的5-Fu濃度。
二、細(xì)胞培養(yǎng)
（1）細(xì)胞復(fù)蘇
①將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到37℃；
②準(zhǔn)備一支15ml離心管，加入5mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，放入37℃水浴鍋中預(yù)熱；
③戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動凍存管以提高復(fù)溫速率；
④將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)備的離心管中，混勻后，1000rpm離心5min；
⑤準(zhǔn)備一個T25培養(yǎng)瓶，寫上細(xì)胞名稱、日期，再加入4mL完全培養(yǎng)基；
⑥離心完成后棄去上清，用1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入T25細(xì)胞培養(yǎng)中，混勻后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。
注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。
（2）細(xì)胞傳代
①當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時，可進(jìn)行傳代；
②在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶內(nèi)的培養(yǎng)基；
③向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入3mL無菌的1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使PBS能夠浸潤到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄PBS；
④向瓶內(nèi)加入消化液1mL（0.25%胰蛋白酶），浸潤底面后放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育3~5min；
⑤孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，若全部消化下來則直接向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基中，將懸液吸入15mL離心管；
注意：如還有部分細(xì)胞未消化下來，可采用分步消化：
a. 準(zhǔn)備一個無菌的15mL離心管，加入2mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基；
b.將消化下來的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；
c.向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶繼續(xù)消化2min左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入2mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。
⑥1000rpm離心5min；
⑦準(zhǔn)備兩個新的T25培養(yǎng)瓶，各加入4mL完全培養(yǎng)基；
⑧離心完成后，棄上清，用2mL完全培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入2個T25培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶各1mL；
⑨水平放置培養(yǎng)瓶，震蕩混勻后將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置