小鼠卵巢顆粒細(xì)胞永生化的培養(yǎng)操作規(guī)程！
小楊 / 2024-03-26 09:13:12
一、產(chǎn)品信息
規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細(xì)胞信息：永生化細(xì)胞
用途：（免疫熒光鑒定）
注意事項：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
二、細(xì)胞詳述
卵巢是雌性動物的生殖器官。卵巢的功能是產(chǎn)生卵以及類固醇激素。它的外表有一層上皮組織，其下方有薄層的結(jié)締組織。卵巢的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可分為皮質(zhì)和髓質(zhì)。皮質(zhì)位于卵巢的周圍部分，主要由卵泡和結(jié)締組織構(gòu)成；髓質(zhì)位于中央，由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，其中有許多血管、淋巴管和神經(jīng)。
卵巢是分泌雌激素的主要器官。卵巢分泌的雌激素主要是雌二醇。卵巢中顆粒細(xì)胞是合成雌激素的場所。其產(chǎn)生過程是使雄烯二酮轉(zhuǎn)變成雌激素：內(nèi)膜細(xì)胞在LH的作用下，使膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)樾巯┒?；顆粒細(xì)胞在FSH的作用，發(fā)育過程中產(chǎn)生芳香化酶，它使雄烯二酮轉(zhuǎn)變成雌激素。形成的雌激素分泌到卵泡液和血液中。
該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因。
注意事項：收到細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代，充液培養(yǎng)基是維持培養(yǎng)基，不能用來培養(yǎng)細(xì)胞。
三、細(xì)胞特性
1)組織來源于實驗動物的正常卵巢組織。
2)細(xì)胞鑒定：卵泡刺激素受體(FSHR)免疫熒光染色為陽性。
3)經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。
4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
5)細(xì)胞生長方式：不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
四、推薦培養(yǎng)基
我們推薦使用原代卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)體系作為體外培養(yǎng)原代卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)基。
名稱 體積 濃度 保存條件
原代卵巢顆粒細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 500ml 1× 4℃、避光
原代卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)添加劑 5ml 100× -20℃、避光
胎牛血清（FBS） 50ml 終濃度10% -20℃、避光
雙抗（青霉素/鏈霉素，P/S） 5ml 100× -20℃、避光
五、產(chǎn)品的運輸和保存
視天氣狀況和運輸距離遠近，公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進行。
1)1mL凍存細(xì)胞懸液裝于1.8ml的凍存管中，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進行運輸；收到細(xì)胞后請盡快解凍復(fù)蘇細(xì)胞進行培養(yǎng)，如無法立刻進行復(fù)蘇操作，凍存細(xì)胞可在-80℃的條件下保存1個月。
2T-25培養(yǎng)瓶充滿完全培養(yǎng)基后進行常溫運輸；收到細(xì)胞后請鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，如鋪瓶率超過85%請立即進行傳代操作，如懸浮的細(xì)胞較多，請將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細(xì)胞能夠再次貼壁。
六、產(chǎn)品使用
（1）本產(chǎn)品僅能用于科研
（2）本產(chǎn)品未通過直接用于活體動物和人的審核
（3）本產(chǎn)品未通過用于活體診斷的審核
七、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
注意：客戶收到細(xì)胞后按照下面的要求操作：培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)液是不含藥物的。待細(xì)胞長到 70-80%的匯合度時，去掉培養(yǎng)液，加入含 16ug/ml 藥物的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱，這段時間可能會有小部分細(xì)胞懸浮起來，但是不要緊，通過換液可以去掉，下面的細(xì)胞待長滿就可以消化傳瓶了，這時可以一直用含藥培養(yǎng)液來消化培養(yǎng)細(xì)胞，一兩代之后可以將藥物濃度提高到 20ug/ml，含藥培養(yǎng)液用于細(xì)胞培養(yǎng)都沒問題的，凍存的時候就不要在凍存液里面加藥物了。
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；添加20ug/ml 5-FLU；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。
對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2、加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
下面T25瓶為例；
1、細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細(xì)胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
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