小鼠單核巨噬細胞白血病細胞的培養(yǎng)操作及應用！
小楊 / 2024-04-08 09:28:04
一、背景
RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）是一種源自小鼠的白血病細胞系，常用于生物學和醫(yī)學研究。這種細胞系是從患有單核細胞白血病的雄性小鼠的脾臟中分離出來的，并經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)而形成的。RAW 264.7細胞具有巨噬細胞的特性，如吞噬作用、抗原提呈和產(chǎn)生細胞因子等。
由于
RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞易于培養(yǎng)和操作，且表現(xiàn)出與原發(fā)性巨噬細胞相似的功能，因此被廣泛用作研究巨噬細胞功能和生物學特性的模型。這些細胞常被用于研究炎癥、感染、免疫應答、細胞信號轉(zhuǎn)導、藥物篩選等領域。
在細胞培養(yǎng)方面，
RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞通常需要在含有DMEM（杜氏改良Eagle培養(yǎng)基）或RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，同時添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的抗生素-抗真菌混合物以維持細胞生長并防止污染。這些細胞通常在37°C、5%CO2的濕潤環(huán)境中生長。
RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞還可以用于研究各種刺激物（如細菌、病毒、寄生蟲、細胞因子等）對巨噬細胞的影響，以及巨噬細胞在免疫反應中的作用。此外，這些細胞也被廣泛用于藥物篩選和毒理學研究，以評估藥物對巨噬細胞功能和生存能力的影響。
1)復蘇RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
利用LPS誘導RAW264.7細胞建立氧化應激和炎癥反應模型,初步證實釀酒酵母β-葡聚糖的抗氧化作用。然后,在氧化應激模型基礎上,探究釀酒酵母β-葡聚糖對RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞抗氧化、抗炎及抗凋亡的分子作用機制,為預防和治療氧化應激相關性疾病提供新的思路。本研究主要從細胞信號通路轉(zhuǎn)導方面對釀酒酵母β-葡聚糖抗氧化、抗炎和抗凋亡作用機制進行研究。
結(jié)果如下：
(1)試驗一以LPS為誘導物,氧化應激和促炎細胞因子作為建立氧化應激和炎癥模型指標,探究LPS對RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞氧化損傷效果。結(jié)果表明:0.1～5μg/m L LPS處理RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞12 h后,細胞內(nèi)氧化應激指標MDA和ROS產(chǎn)生顯著增多,抗氧化指標SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著降低;細胞培養(yǎng)上清液中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α釋放顯著增多,細胞內(nèi)COX-2和i NOS含量顯著升高。綜合多項指標,以1μg/m L LPS作為建立細胞氧化應激和炎癥模型的最佳濃度。
(2)試驗二在試驗一基礎上,初步探討釀酒酵母β-葡聚糖對LPS誘導的RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞氧化應激和炎癥損傷的緩解作用。
結(jié)果表明：釀酒酵母β-葡聚糖增強抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和HO活性,抑制LPS誘導的MDA和ROS產(chǎn)生而發(fā)揮抗氧化作用,降低IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放以及COX-2和i NOS水平而起到抗炎效果,推測可能是釀酒酵母β-葡聚糖激活抗氧化轉(zhuǎn)錄因子從而發(fā)揮預保護作用。這些結(jié)果充分說明β-葡聚糖具有抗氧化和抗炎的雙重調(diào)節(jié)作用,從而抑制細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,進而對RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞起到保護作用。但其調(diào)控抗氧化和抗炎信號轉(zhuǎn)導機制仍需在氧化應激模型中進一步驗證。
(3)試驗三以試驗二為基礎進行深入性研究,本試驗旨在探討β-葡聚糖抑制LPS誘導的RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞氧化應激分子機制。為闡明β-葡聚糖抗氧化的分子機制,我們設計了β-葡聚糖添加試驗,結(jié)果表明:β-葡聚糖能夠激活其受體Dectin-1介導的Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導通路。氧化應激模型中,在LPS抑制Nrf2和HO-1表達的條件下,β-葡聚糖能顯著上調(diào)LPS誘導的Dectin-1、Nrf2和HO-1的表達,抑制ROS產(chǎn)生,但β-葡聚糖這些作用可被Dectin-1抑制劑Laminarin、Nrf2抑制劑ML385和HO-1抑制劑Sn PP逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果表明β-葡聚糖可以通過Dectin-1/Nrf2/HO-1信號通路抑制LPS誘導的RAW 264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）細胞氧化應激。
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