小鼠結(jié)腸癌細胞的背景與應用及培養(yǎng)操作規(guī)程！
小楊 / 2024-04-12 09:18:13
一、背景
小鼠結(jié)腸癌細胞是一種常用于結(jié)腸癌研究的實驗模型。這些細胞來源于小鼠的結(jié)腸癌組織，具有腫瘤細胞的特性，如快速增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等。
小鼠結(jié)腸癌細胞可以用于研究結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展機制，以及探索新的治療手段。通過研究這些細胞在體外和體內(nèi)的行為，可以幫助科學家們更好地理解結(jié)腸癌的生物學特征，以及開發(fā)更有效的治療策略。
此外，小鼠結(jié)腸癌細胞系也常被用于制作腫瘤模型，以模擬人類結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移。這些模型對于研究腫瘤的生物學、測試藥物療效以及研究腫瘤與宿主之間的相互作用都具有重要的意義。
1、小鼠結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640:GIBCO,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸鈉0.11g/L)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）小鼠結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）小鼠結(jié)腸癌細胞凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）小鼠結(jié)腸癌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）小鼠結(jié)腸癌細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍存。
三、應用
研究胡桃醌對結(jié)腸癌CT-26細胞在小鼠體內(nèi)增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的影響,以及胡桃醌促進CT-26腫瘤細胞凋亡和抑制其轉(zhuǎn)移的相關(guān)可能作用機制。同時,探究了胡桃醌治療結(jié)腸癌期間對荷瘤小鼠的機體免疫功能的影響。
選取健康的Balb/c小鼠皮下荷瘤,隨機分為6組,分別為模型組(2%乙醇生理鹽水溶液)、陽性對照組(20mg/kg 5-FU)、胡桃醌高劑量組(2.5mg/kg)、胡桃醌中劑量組(1.25mg/kg)、胡桃醌低劑量組(0.625mg/kg)、聯(lián)合用藥組(胡桃醌2.5mg/kg+5-FU20mg/kg),按體重每日腹腔注射給藥一次,連續(xù)給藥10天。末次給藥結(jié)束24h后,稱重記錄并準備收集血液、胸腺、脾臟、腫瘤組織樣本。血液靜置離心分離得血清,應用Elisa方法檢測ICAM-1、VEGF、GSH、IL-8在小鼠血清中的含量;胸腺和脾臟稱重計算胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù);腫瘤組織測量長徑與短徑計算瘤體積,稱重記錄瘤重;將腫瘤組織切割為兩部分,一部分置于生理鹽水用于流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞周期及凋亡,另一部分固定于4%甲醛溶液,用于HE染色病理觀察以及免疫組化檢測腫瘤組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、β-鏈蛋白的表達水平。
實驗結(jié)果表明,胡桃醌高劑量2.5mg/kg和中劑量1.25mg/kg均可有效抑制結(jié)腸癌CT-26細胞在小鼠體內(nèi)的生長,抑瘤率分別為46.2%和42.4%;胡桃醌與5-FU聯(lián)合應用抑瘤率為74.8%,比胡桃醌與5-FU單獨應用的抑瘤效果好;5-FU治療腫瘤時,小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、體重與模型組相比均顯著性下降,而胡桃醌治療后,小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、體重均無顯著性下降,胡桃醌可使CT-26腫瘤細胞阻滯于G2/M期,并下調(diào)腫瘤細胞中Bcl-2蛋白、β-鏈蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達,上調(diào)Bax與Caspase-3蛋白表達;胡桃醌高劑量2.5mg/kg可顯著降低荷瘤小鼠血清中ICAM-1、VEGF和GSH的含量。
根據(jù)結(jié)果可知胡桃醌在抗腫瘤過程中,與5-FU相比可維持機體的體重和免疫功能;胡桃醌的抗腫瘤作用機制可能是阻滯CT-26腫瘤細胞周期于G2/M期影響其增殖,介導線粒體依賴的Caspase-3凋亡途徑促進腫瘤細胞凋亡,下調(diào)血管生成因子、β-鏈蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白的表達抑制腫瘤細胞浸潤與轉(zhuǎn)移。本研究為胡桃醌成為可能的抗結(jié)腸癌藥物提供新的理論和實驗依據(jù)。
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