嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法檢測鮮乳中抗生素殘留！
小楊 / 2024-04-13 09:22:52
一、檢驗原理
培養(yǎng)基預(yù)先混合嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢，并含有 pH 指示劑（溴甲酚紫）。加入樣品并溫浴后，若該樣品中不含有抗生素或抗生素的濃度低于檢測限，細菌芽孢將在培養(yǎng)基中生長并利用糖產(chǎn)酸，pH 指示劑的紫色變?yōu)辄S色。相反，如果樣品中含有高于檢測限的抗生素，則細菌芽孢不會生長，pH 指示劑的顏色保持不變，仍為紫色。
二、檢驗程序
1、芽孢懸液：
將嗜熱脂肪芽孢桿菌菌種劃線移種于營養(yǎng)瓊脂平板表面，56 ℃培養(yǎng) 24 h 后挑取乳白色半透明圓形特征菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板上再次劃線培養(yǎng)，56 ℃培養(yǎng)24 h 后轉(zhuǎn)入 36 ℃培養(yǎng) 3 d～4 d，鏡檢芽孢產(chǎn)率達到 95%以上時進行芽孢懸液的制備。每 塊平板用 1 mL～3 mL無菌磷酸鹽緩沖液洗脫培養(yǎng)基表面的菌苔（如果使用克氏瓶，每瓶使用無菌磷酸鹽緩沖液 10 mL～20 mL）。將洗脫液 5 000 r/min離心 15 min。取沉淀物加無菌0.03 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）制成 10 ９ cfu/mL 芽孢懸液，置 80 ℃恒溫水浴中 10 min 后，密封防止水分蒸發(fā)，置冰箱保存?zhèn)溆谩?/div>
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2、測試培養(yǎng)基：
在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中加入適量芽孢懸液，混合均勻，使最終的芽孢濃度為 8×10 ５ ～2×10 ６ cfu/mL?；旌涎挎邞乙旱匿寮追幼掀咸烟堑鞍纂伺囵B(yǎng)基分裝小試管，每管 200 μL，密封防止水分蒸發(fā)。這樣配制好的測試培養(yǎng)基可以在冰箱保存 6 個月。
3、培養(yǎng)操作：
吸取樣品100 μL加入含有芽孢的測試培養(yǎng)基中，輕 輕旋轉(zhuǎn)試管混勻。每 份檢樣作二份，另外再作陰性和陽性對照各一份，陽性對照管為 100 μL 青霉素 G 參照溶液，陰性對照管為 100 μL 無抗生素的脫脂乳。于 65℃水浴培養(yǎng) 2.5 h，觀察培養(yǎng)基顏色的變化。如果顏色沒有變化，須再于水浴中培養(yǎng) 30 min 作最終觀察
4、判斷方法：
在白色背景前從側(cè)面和底部觀察小試管內(nèi)培養(yǎng)基顏色。保持培養(yǎng)基原有的紫色為陽性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色或黃綠色為陰性結(jié)果，顏色處于二者之間，為可疑結(jié)果。對于可疑結(jié)果應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)30 min 再進行最終觀察。如果培養(yǎng)基顏色仍然處于黃色－紫色之間，表示抗生素濃度接近方法的最低檢出限，此時建議重新檢測一次。
5、報告:
最終觀察時，培養(yǎng)基依然保持原有的紫色，可以報告為抗生素殘留陽性。
培養(yǎng)基變?yōu)槌庶S色或黃綠色時，可以報告為抗生素殘留陰性。
本方法檢測幾種常見抗生素的最低檢出限為：青霉素3 μg/L，鏈霉素 50 μg/L，慶大霉素 30 μg/L，卡那霉素 50 μg/L。
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