原始菌種和菌液的制備與保存的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程！
小楊 / 2024-05-11 09:18:29
百歐博偉生物：菌種保藏使微生物的代謝活動(dòng)處于最/低的狀態(tài)，但又不至于死亡，從而達(dá)到保藏的目的。規(guī)范菌種原始菌液的制備及長(zhǎng)期保存。
1、定義
原始菌液--由凍干菌或冷凍菌直接傳代的孢子或生長(zhǎng)菌的原始懸浮液。
工作菌液--由原始菌液直接稀釋，或根據(jù)一般試驗(yàn)需要而等量稀釋的特定濃度的孢子或細(xì)菌的懸浮液。
2、總則
微生物室收到實(shí)驗(yàn)菌種后應(yīng)進(jìn)行活化及純化，并進(jìn)行傳代（芽孢桿菌除外）。每一新菌種在適宜的瓊脂平板上劃線分離，檢查是否純種，觀察菌落形態(tài)并用革蘭氏染色或芽孢染色法進(jìn)行鏡檢，如果是芽孢懸浮液，用常規(guī)方法測(cè)定其存活孢數(shù)。
經(jīng)檢查如果滿意，貼上合適的標(biāo)簽，并將貯備菌存放在實(shí)驗(yàn)室專用的冰箱里（2 ～8℃）或冷凍室內(nèi)，以避免與實(shí)驗(yàn)室正在使用的其它菌種相混淆，作好菌種傳代的記錄以便能追蹤傳代史。
生孢梭菌的孢子懸浮菌應(yīng)每年制備一次。
原始菌種的傳代次數(shù)最多傳至第五代。
一、培養(yǎng)基
凍干菌制備原始菌液
由甘油冷凍菌制備原始菌液
1、把凍干菌加入100ml液體培養(yǎng)基后所得的菌作為第一代。
2、從冷凍箱內(nèi)取出冷凍菌，使其在室溫下慢慢融化；
3、把冷凍菌無(wú)菌轉(zhuǎn)移至100ml該菌所適用的液體培養(yǎng)基中；
4、根據(jù)菌種的類型，將接種后的培養(yǎng)基在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)24h或更長(zhǎng)一些時(shí)間；
5、把甘油冷凍菌加入100ml液體培養(yǎng)基后所得的菌作為第二代。
二、由集菌平板制備原始菌液
1、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，把經(jīng)過(guò)24h（或更長(zhǎng)時(shí)間）培養(yǎng)的菌液搖勻，各取1ml，無(wú)菌轉(zhuǎn)移至5只培養(yǎng)基平板上，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液均勻分布于平板表面。不同培養(yǎng)基適用于不同菌種。
2、另用一只平板，劃線分離菌液，培養(yǎng)之，以檢查菌液是否純種。
在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)以上平板，不同菌種所需培養(yǎng)周期不一。
1、生長(zhǎng)菌-24h以內(nèi)即可顯見(jiàn)增長(zhǎng)；
2、孢子-需要3～7天或更長(zhǎng)時(shí)間才能得到50%孢子，這樣可確保提到濃的懸浮液。對(duì)需長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)或培養(yǎng)溫度較高（55℃）的平板進(jìn)行適當(dāng)密封，以免培養(yǎng)基失水干裂。
3、分生孢子，一般需要5～14天才能獲得明顯的分生孢子生長(zhǎng)物，將平板封口，以免分生孢子污染空氣。
4、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，各取約0ml氯化鈉磷酸緩沖液（PBS）加至經(jīng)培養(yǎng)后的集菌平板內(nèi)。
5、用彎曲的接種棒（或無(wú)菌玻璃彎頭）輕輕地刮平板表面，使菌落與平板分離。但注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。傾斜平板，使菌懸液集中于平板一端，用無(wú)菌注射器或無(wú)菌吸管吸取菌懸液，把5只平板中的菌懸液收集于一只大小合適，便于封口的試管中。
三、標(biāo)記
在原始菌液的標(biāo)簽上記述下列內(nèi)容：
1、菌種名稱
2、原始菌種制備編號(hào)（代數(shù)+制備日期）
3、有效期（孢子懸浮液的有效期為一年）
4、操作者姓名（菌液濃度一經(jīng)標(biāo)定后，即應(yīng)補(bǔ)記在標(biāo)簽上）
四、原始菌液的濃度標(biāo)定
1、標(biāo)定孢子初始制備液的濃度并進(jìn)行記錄，以后，每次使用該原始菌液時(shí)，不論直接使用或用其配制工作菌液，都應(yīng)事先重新標(biāo)定其濃度。前一次標(biāo)定濃度僅供參考；
2、除非有定量要求，一般生長(zhǎng)態(tài)菌的原始菌液無(wú)需標(biāo)定，生長(zhǎng)菌很易死亡，因此不能保持穩(wěn)定可靠的濃度。
五、菌種的斜面保存
1、經(jīng)常使用的菌種。將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長(zhǎng)后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2℃～8℃的冰箱中保藏。
2、保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2-4個(gè)月，移種一次。酵母菌兩個(gè)月，細(xì)菌最好每月移種一次。
六、菌液甘油冷凍管保存
1、將液體培養(yǎng)基培養(yǎng)或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的剩余原始菌液中加入足量的無(wú)菌甘油得到10%甘油液。輕輕振搖，使其充分混合；
2、各取0ml上述混合液，無(wú)菌分裝于10支冷凍用小試管或冷凍管中，在管子上注明菌種名稱、菌種號(hào)等以及從冷凍日起2年的有效期。做好記錄，并妥善保存。
3、制備好的菌液甘油冷凍管在-80℃超低溫或液氮罐內(nèi)貯存。
七、液體石蠟管的保藏
1、將液體石蠟分裝于三角燒瓶?jī)?nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，121℃滅菌30min，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。
2、將菌種接種在新鮮瓊脂斜面中，并在相應(yīng)的適宜條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)時(shí)間一般為24h）；
3、在超凈工作臺(tái)下無(wú)菌操作，用無(wú)菌吸管吸取無(wú)菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm，再將菌種管于2℃～8℃保藏。
4、將試管直立，置低溫或室溫下保存。
5、液體石蠟保藏菌種有效期為一年。
八、注意事項(xiàng)
1、每天應(yīng)檢查菌種保藏室或冰箱的溫濕度狀況，并用專用記錄本記錄
2、經(jīng)常檢查菌種管的塞子是否松動(dòng)，如有異常應(yīng)及時(shí)處理
3、經(jīng)多次傳代的菌種，應(yīng)定期檢查其純度及其變異性（與原始記錄相比較），若有異常，應(yīng)更換新菌種
4、帶有實(shí)驗(yàn)菌的廢棄物和超過(guò)有效期的菌種，121℃高壓滅菌后按有關(guān)規(guī)定銷毀，并認(rèn)真填寫"檢定菌液使用、銷毀記錄表。
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