人食道鱗狀癌細(xì)胞的處理方法與培養(yǎng)操作規(guī)程！
小楊 / 2024-06-13 09:35:12
一、細(xì)胞簡(jiǎn)介
規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細(xì)胞信息：OE21
生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)
培養(yǎng)體系：RPMI1640+2mMGlutamine+10%FBS
傳代方法：1：2傳代
細(xì)胞形態(tài)：上皮樣
凍存條件：無(wú)血清細(xì)胞凍存液
用途：研究
注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類(lèi)或動(dòng)物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫(kù)為準(zhǔn)）
二、細(xì)胞特性
1)細(xì)胞來(lái)源于動(dòng)物正常子宮組織。
2)細(xì)胞鑒定：波形蛋白（Vimentin）免疫熒光染色為陽(yáng)性。
3)經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。
4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
5)細(xì)胞生長(zhǎng)方式：長(zhǎng)梭形，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
三、產(chǎn)品的運(yùn)輸和保存
視天氣狀況和運(yùn)輸距離遠(yuǎn)近，公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進(jìn)行。
1)1mL凍存細(xì)胞懸液裝于1.8ml的凍存管中，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進(jìn)行運(yùn)輸；收到細(xì)胞后請(qǐng)盡快解凍復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，如無(wú)法立刻進(jìn)行復(fù)蘇操作，凍存細(xì)胞可在-80℃的條件下保存1個(gè)月。
2)T-25培養(yǎng)瓶充滿完全培養(yǎng)基后進(jìn)行常溫運(yùn)輸；收到細(xì)胞后請(qǐng)鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，如鋪瓶率超過(guò)85%請(qǐng)立即進(jìn)行傳代操作，如懸浮的細(xì)胞較多，請(qǐng)將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜以幫助未死亡的懸浮細(xì)胞能夠再次貼壁。
四、細(xì)胞收到后處理方法
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是細(xì)胞運(yùn)輸?shù)淖詈棉k法。收到細(xì)胞回到自己的實(shí)驗(yàn)室后，先打開(kāi)外包裝，用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格無(wú)菌操作，培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)。鏡下觀察：未超過(guò)80%匯合度時(shí)，可將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，加入6ml完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)；超過(guò)80%匯合度時(shí)，根據(jù)情況傳代或者凍存，具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松）
五、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。棄培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入到凍存液中。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3、輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
PS：若客戶收到2ml小管細(xì)胞，收到細(xì)胞后，用75%酒精噴灑整個(gè)管子消毒后放到超凈臺(tái)或安全柜內(nèi)，嚴(yán)格無(wú)菌操作；將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿，加入5ml左右完全培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度：若密度未超過(guò)80%，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存。若密度超過(guò)80%，可直接進(jìn)行傳代（方法同上）。
對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中。
六、注意事項(xiàng)
1、細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問(wèn)題，細(xì)胞丟失、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等；
2、細(xì)胞污染問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品48小時(shí)內(nèi)，給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
3、常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置24小時(shí)后，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)后，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活，（需提供真實(shí)清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片）；
4、干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置4小時(shí)候并且未開(kāi)封，出現(xiàn)污染；
5、細(xì)胞活性問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力；
6、細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3天請(qǐng)拍照，3天未告知的，視為產(chǎn)品合格。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問(wèn)題有提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的，并跟技術(shù)人員溝通的，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的。
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