血液瓊脂基礎(chǔ)的檢驗原理與使用說明及應(yīng)用研究！
小楊 / 2024-12-11 09:22:43
一、知識背景
血液瓊脂基礎(chǔ)又叫做血平板、血平皿，是一種富含動物血液成分的瓊脂平板，常用于微生物學(xué)實驗中檢測不同細(xì)菌對血液成分的反應(yīng)；血瓊脂平板通常由瓊脂、肉湯、羊血或牛血等成分組成，其中的蛋白胨和牛肉粉主要提供細(xì)菌生長所需要的碳源、氮源、氨基酸及維生素；氯化鈉維持培養(yǎng)基中的滲透壓，瓊脂用做凝固劑。脫纖維羊血一方面提供一些特殊的生長因子，另一方面用于觀察溶血反應(yīng)。血瓊脂平板可以用于分離和鑒定許多不同類型的微生物，如
溶血性鏈球菌、
李斯特氏菌、
弧菌、
金黃色葡萄球菌和
蠟樣芽孢桿菌等。
胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供碳氮源、維生素和生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；脫纖維羊血提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。
溶血現(xiàn)象有關(guān)不同細(xì)菌在血瓊脂平板上的溶血情況：
（1）肺炎鏈球菌的α溶血和乙型溶血性鏈球菌的β溶血，α溶血又稱草綠色溶血，菌落周圍會形成草綠色的溶血環(huán)，β溶血又稱完全溶血，菌落周圍會形成透明的溶血環(huán)。
（2）各種李斯特氏菌的溶血及協(xié)同溶血情況。伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌和單增李斯特氏菌呈現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象，英諾克李斯特氏菌無溶血現(xiàn)象；伊氏李斯特氏菌靠近馬紅球菌溶血增強，單增李斯特氏菌靠近馬紅球菌和金黃色葡萄球菌落血均增強。
（3）我妻氏培養(yǎng)基上弧菌的溶血情況：副溶血性弧菌（ATCC33847）菌落周圍有透明的β溶血環(huán)，溶藻弧菌菌落周圍無溶血環(huán)。
（4）金黃色葡萄球菌的溶血情況：金黃色葡萄球菌（ATCC6538）菌落周圍呈現(xiàn)完全溶血。
血瓊脂基礎(chǔ)的選擇在實際工作中，可根據(jù)要求選擇不同的血瓊脂基礎(chǔ)，如營養(yǎng)瓊脂、豆粉瓊脂或哥倫比亞瓊脂（用于營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌的培養(yǎng)及溶血試驗）等，加蒸餾水溶解后高壓滅菌。冷卻至50℃～55℃，加入一定量的血液，緩慢混勻后傾注平板。通常來說，如果只是想看一下溶血情況，只要用最基本的營養(yǎng)性瓊脂，加入脫纖維羊血制成平板使用即可。但《GB4789食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗》系列標(biāo)準(zhǔn)中，針對不同細(xì)菌檢驗時，所規(guī)定的血瓊脂的基礎(chǔ)配方又有所不同。
三、使用說明
稱取本品33.0g于1L蒸餾水或去離子水中（可按比例增加或減少配制量），加熱煮沸至完全溶解,分裝,121℃高壓滅菌15分鐘或115℃滅菌30分鐘，滅菌結(jié)束后請搖勻，以防瓊脂沉積于器皿底部而凝固，冷至50-55℃，無菌操作沿瓶壁緩緩加入5-7%于35℃保溫過的無菌脫纖維綿羊血，輕輕搖勻，傾注平板，凝固，備用。
四、應(yīng)用
以分離純化并鑒定的剛果嗜皮菌綿羊株和發(fā)病盤羊病變皮膚為試驗材料,采用平板涂抹的方法,研究病料樣品的不同的預(yù)處理方法、血液瓊脂基礎(chǔ)、增菌活化劑、雜菌抑制劑對剛果嗜皮菌的分離效果的影響,以期建立一種用于實驗室分離純化剛果嗜皮菌的高效簡便的方法,并在此基礎(chǔ)上,對發(fā)病盤羊皮膚病料進行剛果嗜皮菌的分離,并對剛果嗜皮菌盤羊分離株進行菌落與形態(tài)學(xué)鑒定、家兔人感染試驗、PCR鑒定及RAPD分析。
1、皮膚病料在無菌蒸餾水室溫靜置浸泡15天后,取上清接種于pH7.0 6%酵母膏活化液中,60℃培養(yǎng)30min,再涂于綿羊血液瓊脂平板,37℃培養(yǎng)48h,可獲得較多的剛果嗜皮菌典型菌落。菌落經(jīng)染色鏡檢,可觀察到呈不規(guī)則狀及少量的圓形孢子。而采用將病料懸液經(jīng)37℃水浴1h、燭罐處理15min均未分離到目地菌；0.05%SDS及0.05%SDS 6%蛋白胨的活化液對病料中的剛果嗜皮菌無活化作用。6%酵母膏的最佳活化溫度為60℃30min；剛果嗜皮菌在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上生長不良,在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)上不生長,在LB瓊脂培養(yǎng)基上的生長情況不如綿羊血液瓊脂基礎(chǔ)；常用于放線菌分離培養(yǎng)中防止雜菌生長的孔雀石綠和重鉻酸鉀抑菌劑,在本試驗中無明顯抑制雜菌生長的作用,不適合作為剛果嗜皮菌分離培養(yǎng)的選擇性抑菌劑。本試驗所建立的剛果嗜皮菌分離純化方法可為動物與人類嗜皮菌病的病原學(xué)研究提供有用的技術(shù)手段。
2、采用本研究建立的剛果嗜皮菌分離方法,從發(fā)病盤羊皮膚病料中分離獲得剛果嗜皮菌(盤羊株),經(jīng)培養(yǎng)特性、菌體染色與形態(tài)特性、PCR檢測、分離株間接免疫酶染色鑒定,以及家兔感染試驗均與綿羊分離株相同。說明來自同一地區(qū)發(fā)病的剛果嗜皮菌綿羊和盤羊分離株的某些生物學(xué)特性基本一致。
3、對剛果嗜皮菌綿羊株和盤羊株的DNA進行隨機引物擴增多態(tài)性DNA(RAPD)分析,擴增產(chǎn)物有一定的多態(tài)性,根據(jù)歐氏遺傳距離公式計算出遺傳距離為0.6667,顯示盤羊株與綿羊株的基因組DNA有不同程度的差異。
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