微生物標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)活的準(zhǔn)備工作與活化步驟及注意事項！
小楊 / 2025-03-20 09:36:11
標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活是微生物實驗中的基礎(chǔ)操作，目的是將保存的菌種恢復(fù)到活性狀態(tài)，確保其可用于后續(xù)實驗。以下是標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)活的詳細(xì)步驟和注意事項：
一、準(zhǔn)備工作
1、確認(rèn)菌株信息
查閱菌株說明書，明確其培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、氣體條件（需氧/厭氧）及保存方式（凍干粉、甘油管、斜面等）。
確認(rèn)菌株的生物安全等級（如BSL-1、BSL-2），采取相應(yīng)的防護(hù)措施。
2、準(zhǔn)備培養(yǎng)基
根據(jù)菌株需求配制液體和固體培養(yǎng)基（如LB培養(yǎng)基、TSB、血瓊脂等），滅菌后備用。
對于苛養(yǎng)菌（如某些厭氧菌或營養(yǎng)缺陷菌），需添加特定生長因子或血清。
3、器材準(zhǔn)備
無菌接種環(huán)、移液槍、槍頭、培養(yǎng)皿、試管等。
超凈工作臺（提前紫外滅菌30分鐘）、恒溫培養(yǎng)箱、搖床（針對液體培養(yǎng)）。
4、預(yù)培養(yǎng)條件
預(yù)熱培養(yǎng)基至適宜溫度（如37℃），避免冷刺激影響復(fù)蘇。
二、菌株活化步驟
1、凍干粉菌株的復(fù)活
（1）復(fù)水溶解：
在超凈臺中，用無菌移液槍吸取0.5-1 mL液體培養(yǎng)基或?qū)Ｓ脧?fù)溶液（如TSB），注入凍干粉安瓿瓶，輕輕吹吸混勻。
（2）靜置活化：
將菌懸液轉(zhuǎn)移至無菌試管中，靜置30分鐘至1小時（某些菌需預(yù)培養(yǎng)）。
（3）初代培養(yǎng)：
液體培養(yǎng)：取部分菌懸液接種至液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)（如37℃、200 rpm）。
固體培養(yǎng)：劃線接種至固體培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)。
2、甘油管或冷凍保存菌的復(fù)活
（1）快速解凍：
將甘油管從-80℃或液氮中取出，迅速置于37℃水浴中融化（10-20秒）。
避免反復(fù)凍融，解凍后立即使用。
（2）接種培養(yǎng)：
取少量菌液劃線或接種至液體培養(yǎng)基，根據(jù)菌株需求培養(yǎng)（如厭氧菌需使用厭氧罐）。
三、復(fù)蘇后驗證
1、觀察生長情況
液體培養(yǎng)基：觀察濁度變化（如OD600值）。
固體培養(yǎng)基：檢查菌落形態(tài)（大小、顏色、邊緣、溶血性等是否與標(biāo)準(zhǔn)一致）。
2、染色鑒定
革蘭氏染色：確認(rèn)菌體形態(tài)（球菌/桿菌）和染色特性（G?/G?）。
抗酸染色（針對分枝桿菌屬）。
3、生化試驗
進(jìn)行關(guān)鍵生化反應(yīng)（如氧化酶、觸酶、糖發(fā)酵試驗等），比對標(biāo)準(zhǔn)特征。
4、分子鑒定（可選）
16S rRNA測序或特異性PCR，確認(rèn)菌株基因型。
5、純度檢查
連續(xù)傳代后觀察是否污染雜菌。
四、菌株保存
1、短期保存
斜面或半固體穿刺培養(yǎng)基（4℃保存，1-3個月）。
2、長期保存
甘油管（15%-30%甘油，-80℃或液氮保存）。
凍干保存（需專用凍干機(jī)）。
五、注意事項
1、無菌操作：全程在超凈臺中進(jìn)行，避免污染。
2、生物安全：
高致病性菌株需在生物安全柜（BSC）中操作，廢棄物高壓滅菌。
3、菌株穩(wěn)定性：
避免多次傳代導(dǎo)致表型或基因型改變，建議使用低傳代數(shù)菌株。
4、特殊菌株處理：
對氧氣敏感的菌株需在厭氧環(huán)境中操作（如厭氧工作站）。
對溫度敏感的菌株避免高溫解凍。
六、常見問題與解決
1、菌株不生長：
檢查培養(yǎng)基成分、pH、溫度是否合適；確認(rèn)保存菌株是否失活。
2、污染雜菌：
重新劃線純化，或使用選擇性培養(yǎng)基。
3、表型異常：
可能因保存時間過長或傳代過多，建議重新復(fù)活原始菌株。
通過以上步驟，可有效復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)菌株并確保其活性和純度，為后續(xù)實驗提供可靠菌源。
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