組織單細胞懸液制備的標準流程及注意事項有哪些？
小楊 / 2025-04-03 09:09:40
百歐博偉生物：制備高質(zhì)量的單細胞懸液是許多實驗（如流式細胞術(shù)、單細胞測序、原代細胞培養(yǎng)等）的關(guān)鍵步驟。以下是組織單細胞懸液制備的標準流程及注意事項：
一、實驗前準備
1、儀器與耗材
無菌手術(shù)器械（剪刀、鑷子、刀片等）
細胞篩（70 μm、40 μm尼龍濾網(wǎng)）
離心管、培養(yǎng)皿、移液器
恒溫搖床或水浴鍋（37℃）
離心機
2、試劑
磷酸鹽緩沖液（PBS，含抗生素如青霉素/鏈霉素）
組織消化酶（根據(jù)組織類型選擇）：
膠原酶（Collagenase I/IV，適用于結(jié)締組織）
胰酶（Trypsin，適用于上皮組織）
透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，輔助消化細胞外基質(zhì)）
DNA酶（DNase I，防止DNA導(dǎo)致細胞粘連）
終止液（含血清的培養(yǎng)基或含EDTA的緩沖液）
臺盼藍（檢測細胞活性）
3、組織處理原則
保持低溫操作（冰上處理，減少細胞死亡）。
快速處理新鮮組織（離體后盡快操作）。
二、標準制備流程
1、組織取材與清洗
將組織置于預(yù)冷的PBS中，去除脂肪、血管等非目標組織。
用PBS清洗3次，去除血液和雜質(zhì)。
2、組織剪碎
將組織轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用無菌剪刀剪成1-3 mm³的小塊。
加入少量PBS保持濕潤。
3、酶消化
根據(jù)組織類型選擇消化液（示例）：
實體瘤/堅硬組織：膠原酶IV（1-2 mg/mL）+ DNase I（20 μg/mL）
脾/淋巴結(jié)：膠原酶D + 透明質(zhì)酸酶
上皮組織：胰酶-EDTA
將組織塊浸泡在消化液中，37℃振蕩消化（15-60分鐘，具體時間需預(yù)實驗優(yōu)化）。
每隔10分鐘輕柔吹打一次，加速解離。
4、終止消化
加入含血清的培養(yǎng)基或EDTA緩沖液終止反應(yīng)（血清抑制胰酶活性）。
用移液器反復(fù)吹打組織懸液，直至無明顯大塊組織。
5、過濾與離心
將懸液通過70 μm細胞篩過濾，去除未消化的組織塊。
收集濾液，300-400 ×g 離心5分鐘，棄上清。
用PBS重懸細胞，再次通過40 μm濾網(wǎng)（進一步提高單細胞率）。
6、細胞清洗與重懸
用PBS或培養(yǎng)基洗滌細胞2次，離心去除殘留酶和碎片。
重懸于適量緩沖液中（如PBS + 0.04% BSA）。
7、細胞計數(shù)與活性檢測
臺盼藍染色法：活細胞率需 >85%（若活性低，可優(yōu)化消化時間或酶濃度）。
調(diào)整細胞濃度至目標值（如1×10? cells/mL）。
三、不同組織類型的注意事項
1、實體瘤
可能需要機械輔助（如用注射器反復(fù)吹打或輕柔研磨）。
使用復(fù)合酶（如膠原酶 + 分散酶 Dispase）。
2、脾臟/淋巴結(jié)
可直接機械研磨（用注射器活塞壓碎），無需長時間酶消化。
3、肝臟/腎臟
膠原酶消化后需多次洗滌去除肝細胞碎片。
4、腦組織
使用低濃度胰酶（0.25%）+ DNase，避免過度消化神經(jīng)元。
四、常見問題與解決方案
五、質(zhì)量控制
顯微鏡觀察：確認細胞為單個分散，無明顯團塊或碎片。
流式細胞術(shù)檢測：通過前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）評估細胞均一性。
功能性驗證：根據(jù)后續(xù)實驗（如細胞培養(yǎng)、染色）結(jié)果反向優(yōu)化流程。
通過以上步驟，可高效制備高質(zhì)量單細胞懸液，為下游實驗奠定基礎(chǔ)。不同組織需靈活調(diào)整方案，建議通過預(yù)實驗確定最佳條件。
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