流式細胞術實驗前的準備工作與實驗步驟及注意事項！
小楊 / 2025-04-18 09:44:45
流式細胞術（Flow Cytometry）是一種通過檢測細胞表面或內部標記物來分析細胞特性的技術，廣泛應用于免疫學、腫瘤學等領域。以下是流式細胞術的常規(guī)實驗步驟：
一、實驗前準備
1、儀器準備
打開流式細胞儀，預熱激光器，運行校準微球進行儀器校準。
檢查鞘液和廢液桶，確保液量充足。
2、試劑準備
PBS緩沖液（含1% BSA或FBS，用于封閉非特異性結合）。
熒光標記抗體（根據(jù)實驗需求選擇單標或多色組合）。
細胞固定/破膜試劑（如進行胞內染色）。
可選：細胞活性染料（區(qū)分死細胞）。
3、樣本制備
細胞懸液：貼壁細胞用胰酶消化后重懸，懸浮細胞直接收集。
血液樣本：用紅細胞裂解液去除紅細胞。
組織樣本：機械或酶解（如膠原酶）消化成單細胞懸液。
用40 μm濾網過濾細胞，去除細胞團塊，調整細胞密度為1×10?~1×10?/mL。
二、抗體標記（表面染色）
1、封閉（可選）
加入含1% BSA或同源血清的PBS，室溫避光孵育10分鐘，封閉非特異性結合位點。
2、抗體孵育
將細胞懸液分裝至流式管，每管加入適量熒光抗體（參考說明書，通常1~5 μg/10?細胞）。
避光，4℃孵育30分鐘（或室溫15分鐘）。
3、洗滌
加入2 mL PBS，300×g離心5分鐘，棄上清，重復2次。
三、胞內染色（可選步驟）
1、固定
加入4%多聚甲醛（PFA）或預冷的70%乙醇，室溫避光固定15~20分鐘。
2、破膜
用破膜緩沖液（含0.1% Triton X-100或商品化破膜劑）處理細胞10~15分鐘。
3、胞內抗體孵育
加入針對胞內抗原的抗體（如細胞因子、轉錄因子），避光孵育30~60分鐘，洗滌2次。
四、上機檢測
1、樣本重懸
用300~500 μL PBS重懸細胞，立即上機檢測（或4℃避光保存，24小時內檢測）。
2、儀器設置
設置閾值（FSC/SSC排除碎片），調節(jié)電壓使細胞群位于合適區(qū)域。
使用單陽對照調節(jié)熒光補償（補償矩陣）。
3、數(shù)據(jù)采集
每個樣本至少采集1×10?個細胞，保存為FCS格式文件。
五、數(shù)據(jù)分析
1、圈門策略
Step 1: FSC-A vs SSC-A，圈出目標細胞群（排除碎片和死細胞）。
Step 2: 排除細胞團塊（FSC-H vs FSC-A）。
Step 3: 根據(jù)熒光通道分析目標標記物表達。
2、軟件分析
使用FlowJo、BD FACSDiva、Kaluza等軟件分析陽性細胞比例、平均熒光強度（MFI）。
六、注意事項
1、細胞活性：盡量保持細胞活性＞90%（死細胞易非特異性結合）。
2、抗體用量：需預實驗優(yōu)化抗體濃度，避免過量導致背景高。
3、同型對照：使用同型IgG作為陰性對照，排除非特異性信號。
4、多色實驗：注意熒光染料的光譜重疊，合理設計panel。
以上步驟可根據(jù)具體實驗需求調整，如細胞周期、凋亡檢測需額外處理。
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