食品金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng)與生化鑒定及注意事項！
小楊 / 2025-05-08 09:48:40
食品中
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢測程序通常遵循國家標準或國際標準，以下是一般檢測流程的詳細步驟：
一、樣品采集與處理
1、無菌采樣
使用無菌工具采集食品樣本（固體、液體或半固體），避免交叉污染。
樣本量通常為25 g或25 mL，需冷藏（2~8℃）運輸并盡快檢測。
2、樣品預處理
固體樣品：加入225 mL無菌緩沖蛋白胨水（BPW）或0.1%蛋白胨水，均質(zhì)處理。
液體樣品：直接取25 mL檢測，或稀釋后使用。
二、選擇性增菌培養(yǎng)
1、初次增菌（必要時）
若樣品可能含受損菌體，使用7.5%氯化鈉肉湯（或腦心浸液肉湯，BHI）在35~37℃培養(yǎng)18~24小時，促進目標菌復蘇。
2、選擇性增菌（針對高競爭性樣品）
轉(zhuǎn)種至含7.5%氯化鈉的胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），35~37℃培養(yǎng)24~48小時。
三、分離培養(yǎng)（選擇性平板）
1、劃線接種
取增菌液劃線接種至選擇性培養(yǎng)基：
瓊脂：典型菌落為黑色、光滑，周圍有渾濁帶和透明圈（卵磷脂酶活性）。
血瓊脂平板：菌落呈灰白色，周圍有β-溶血環(huán)。
35~37℃培養(yǎng)24~48小時。
2、可疑菌落篩選
挑取典型菌落（平板優(yōu)先）進行純培養(yǎng)（如血瓊脂或TSA）。
四、生化鑒定
1、初步鑒定
革蘭染色：鏡檢為革蘭陽性球菌，呈葡萄串狀排列。
凝固酶試驗（關(guān)鍵指標）：
試管法：與兔血漿混合，35℃培養(yǎng)4~6小時，凝固為陽性。
玻片法：菌落與血漿混合后10秒內(nèi)凝集。
過氧化氫酶試驗：陽性（區(qū)分鏈球菌）。
2、輔助試驗（必要時）
甘露醇發(fā)酵試驗：
金黃色葡萄球菌可發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。
DNA酶試驗：在含甲苯胺藍的DNA酶瓊脂上形成粉紅色暈圈。
耐熱核酸酶檢測：煮沸后仍能分解DNA（特異性高）。
五、分子生物學鑒定（可選）
1、PCR檢測
擴增特異性基因。
2、質(zhì)譜鑒定
MALDI-TOF MS快速鑒定菌種。
六、腸毒素檢測（如需要）
ELISA法：檢測腸毒素。
膠體金試紙條：快速篩查。
PCR法：檢測腸毒素基因。
七、結(jié)果報告
1、定量檢測（活菌計數(shù)）
按Baird-Parker平板典型菌落數(shù)計算CFU/g（或CFU/mL）。
公式：菌落數(shù) = 平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù)。
2、定性檢測
報告檢出/未檢出金黃色葡萄球菌。
3、標準參考
中國《GB 4789.10-2016》：n=5, c=2, m=10² CFU/g, M=10³ CFU/g（具體限值依食品類別調(diào)整）。
八、注意事項
生物安全：操作應(yīng)在生物安全二級實驗室進行。
交叉污染：嚴格區(qū)分無菌操作區(qū)與污染區(qū)，避免假陽性。