小鼠細(xì)胞分離液的制備方法與操作步驟及質(zhì)量控制！
小楊 / 2025-05-17 09:11:09
小鼠細(xì)胞分離液的制備與質(zhì)量控制是細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的基礎(chǔ)操作，需確保分離的細(xì)胞活性、純度及功能完整性。以下是詳細(xì)步驟及質(zhì)量控制要點：
一、小鼠細(xì)胞分離液的制備
1、常用試劑選擇
基礎(chǔ)分離液：Hanks平衡鹽溶液或磷酸鹽緩沖液，含Ca²?/Mg²?（維持細(xì)胞膜完整性）或無Ca²?/Mg²?（減少細(xì)胞聚集）。
酶解液：
膠原酶（Ⅰ/Ⅳ型）：適用于實體組織（如肝、肺、腫瘤）。
DNaseⅠ：降解DNA減少細(xì)胞團(tuán)黏連。
添加劑：2-10%胎牛血清或牛血清白蛋白，用于抑制酶活性并保護(hù)細(xì)胞。
2、操作流程
組織獲?。?/div>
安樂死小鼠后迅速取材，置于預(yù)冷HBSS/PBS中。
剔除血管、脂肪等非目標(biāo)組織。
機(jī)械解離：
剪碎組織至1-3 mm³碎塊。
使用注射器活塞輕柔研磨或70 μm細(xì)胞篩過濾。
酶消化：
加入含酶的分離液（如0.1%膠原酶+0.01% DNaseⅠ），37℃振蕩消化10-30分鐘。
每10分鐘觀察一次，避免過度消化（導(dǎo)致細(xì)胞死亡）。
終止消化：
加入含血清的培養(yǎng)基中和酶活性。
離心（300×g，5分鐘）收集細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次。
純化：
密度梯度離心分離特定細(xì)胞亞群。
磁珠分選（MACS）或流式分選（FACS）提高純度。
二、質(zhì)量控制關(guān)鍵指標(biāo)
1、細(xì)胞活性檢測
臺盼藍(lán)染色：活細(xì)胞拒染，死細(xì)胞呈藍(lán)色。活性需＞85%（理想＞90%）。
Calcein-AM/PI雙染：流式細(xì)胞術(shù)量化活/死細(xì)胞比例。
2、純度評估
流式細(xì)胞術(shù)：檢測特定表面標(biāo)志物。
免疫熒光/組化：驗證目標(biāo)細(xì)胞特異性標(biāo)記。
3、無菌性檢測
微生物培養(yǎng)：取分離液接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48小時，觀察渾濁度。
支原體檢測：PCR或Hoechst染色確認(rèn)無污染。
4、功能性驗證
增殖能力：CCK-8或EdU染色檢測細(xì)胞生長。
特異性功能：如肝細(xì)胞白蛋白分泌、免疫細(xì)胞細(xì)胞因子釋放。
5、其他參數(shù)
滲透壓：270-310 mOsm/kg（與生理條件匹配）。
pH值：7.2-7.4（CO?培養(yǎng)箱中需調(diào)整）。
內(nèi)毒素檢測：LAL法檢測，要求＜0.1 EU/mL（尤其用于體內(nèi)實驗）。
三、常見問題與優(yōu)化
1、低細(xì)胞活性：
縮短消化時間，預(yù)冷操作臺，優(yōu)化酶濃度。
避免反復(fù)離心，使用含BSA的緩沖液減少機(jī)械損傷。
2、雜質(zhì)過多：
增加過濾步驟（40 μm濾網(wǎng)），或梯度離心去除紅細(xì)胞/碎片。
3、微生物污染：
全程無菌操作，試劑過濾除菌（0.22 μm濾膜）。
4、細(xì)胞聚集：
加入DNaseⅠ（10-100 U/mL）或EDTA（0.5-2 mM）。
四、注意事項
批次記錄：記錄分離液配制時間、濃度、操作人員，確?？勺匪菪浴?/div>
個性化調(diào)整：不同組織（如脾臟、腫瘤、腦）需優(yōu)化酶組合及消化時間。
凍存保護(hù)：若需保存細(xì)胞，使用含10% DMSO的凍存液，逐步降溫至-80℃或液氮。
通過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，可確保分離的小鼠細(xì)胞適用于下游實驗（如原代培養(yǎng)、移植、分子機(jī)制研究），提高實驗結(jié)果的可靠性。
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