小鼠細胞分離液的制備方法與操作步驟及質(zhì)量控制!
小楊 / 2025-05-17 09:11:09
小鼠細胞分離液的制備與質(zhì)量控制是細胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的基礎(chǔ)操作,需確保分離的細胞活性、純度及功能完整性。以下是詳細步驟及質(zhì)量控制要點:
一、小鼠細胞分離液的制備
1、常用試劑選擇
基礎(chǔ)分離液:Hanks平衡鹽溶液或磷酸鹽緩沖液,含Ca²?/Mg²?(維持細胞膜完整性)或無Ca²?/Mg²?(減少細胞聚集)。
酶解液:
膠原酶(Ⅰ/Ⅳ型):適用于實體組織(如肝、肺、腫瘤)。
DNaseⅠ:降解DNA減少細胞團黏連。
添加劑:2-10%胎牛血清或牛血清白蛋白,用于抑制酶活性并保護細胞。
2、操作流程
組織獲?。?/div>
安樂死小鼠后迅速取材,置于預(yù)冷HBSS/PBS中。
剔除血管、脂肪等非目標組織。
機械解離:
剪碎組織至1-3 mm³碎塊。
使用注射器活塞輕柔研磨或70 μm細胞篩過濾。
酶消化:
加入含酶的分離液(如0.1%膠原酶+0.01% DNaseⅠ),37℃振蕩消化10-30分鐘。
每10分鐘觀察一次,避免過度消化(導(dǎo)致細胞死亡)。
終止消化:
加入含血清的培養(yǎng)基中和酶活性。
離心(300×g,5分鐘)收集細胞,用PBS洗滌2-3次。
純化:
密度梯度離心分離特定細胞亞群。
磁珠分選(MACS)或流式分選(FACS)提高純度。
二、質(zhì)量控制關(guān)鍵指標
1、細胞活性檢測
臺盼藍染色:活細胞拒染,死細胞呈藍色?;钚孕瑁?5%(理想>90%)。
Calcein-AM/PI雙染:流式細胞術(shù)量化活/死細胞比例。
2、純度評估
流式細胞術(shù):檢測特定表面標志物。
免疫熒光/組化:驗證目標細胞特異性標記。
3、無菌性檢測
微生物培養(yǎng):取分離液接種于LB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24-48小時,觀察渾濁度。
支原體檢測:PCR或Hoechst染色確認無污染。
4、功能性驗證
增殖能力:CCK-8或EdU染色檢測細胞生長。
特異性功能:如肝細胞白蛋白分泌、免疫細胞細胞因子釋放。
5、其他參數(shù)
滲透壓:270-310 mOsm/kg(與生理條件匹配)。
pH值:7.2-7.4(CO?培養(yǎng)箱中需調(diào)整)。
內(nèi)毒素檢測:LAL法檢測,要求<0.1 EU/mL(尤其用于體內(nèi)實驗)。
三、常見問題與優(yōu)化
1、低細胞活性:
縮短消化時間,預(yù)冷操作臺,優(yōu)化酶濃度。
避免反復(fù)離心,使用含BSA的緩沖液減少機械損傷。
2、雜質(zhì)過多:
增加過濾步驟(40 μm濾網(wǎng)),或梯度離心去除紅細胞/碎片。
3、微生物污染:
全程無菌操作,試劑過濾除菌(0.22 μm濾膜)。
4、細胞聚集:
加入DNaseⅠ(10-100 U/mL)或EDTA(0.5-2 mM)。
四、注意事項
批次記錄:記錄分離液配制時間、濃度、操作人員,確??勺匪菪浴?/div>
個性化調(diào)整:不同組織(如脾臟、腫瘤、腦)需優(yōu)化酶組合及消化時間。
凍存保護:若需保存細胞,使用含10% DMSO的凍存液,逐步降溫至-80℃或液氮。
通過嚴格的質(zhì)量控制,可確保分離的小鼠細胞適用于下游實驗(如原代培養(yǎng)、移植、分子機制研究),提高實驗結(jié)果的可靠性。
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