真菌原生質(zhì)體制備技術(shù)流程及質(zhì)量控制與應(yīng)用示例！
小楊 / 2025-05-23 09:49:12
百歐博偉生物：真菌原生質(zhì)體制備技術(shù)是通過去除真菌細(xì)胞壁獲得僅由細(xì)胞膜包裹的活性原生質(zhì)體的方法，廣泛應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合、基因編輯及生理生化研究。以下是詳細(xì)技術(shù)流程及關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
一、制備流程
1、材料準(zhǔn)備
菌株選擇：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇真菌（如
酵母、
絲狀真菌）。
酶解液：含裂解酶（如裂解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶）、滲透壓穩(wěn)定劑（0.6-1.2 M山梨醇、蔗糖）、緩沖液（pH 5.8-7.0的磷酸鹽）。
預(yù)處理試劑：β-巰基乙醇（破壞二硫鍵）、EDTA（螯合金屬離子）。
其他：離心機(jī)、恒溫?fù)u床、無菌過濾器、顯微鏡。
2、菌體培養(yǎng)
菌絲體培養(yǎng)：絲狀真菌接種于液體培養(yǎng)基，25-30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（12-48小時）。
孢子收集（可選）：用無菌水或緩沖液刮取孢子，過濾去除菌絲碎片。
3、預(yù)處理
菌絲/孢子用預(yù)處理緩沖液（含β-巰基乙醇）洗滌，室溫孵育10-30分鐘，軟化細(xì)胞壁。
離心（3000-5000 rpm, 5分鐘）去除預(yù)處理液，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2-3次。
4、酶解
將菌體懸浮于酶解液中（酶濃度通常為10-20 mg/mL），30-37℃溫和振蕩（50-100 rpm）孵育1-3小時。
關(guān)鍵點(diǎn)：定時取樣顯微鏡觀察（40×物鏡），細(xì)胞變圓且釋放內(nèi)容物表明成功。
5、終止與純化
加入預(yù)冷的滲透壓穩(wěn)定劑終止反應(yīng)，離心（2000 rpm, 5分鐘）收集上清中的原生質(zhì)體。
用高滲液（如山梨醇溶液）洗滌2-3次，去除殘留酶和碎片。
6、保存
原生質(zhì)體懸浮于含滲透壓穩(wěn)定劑的保存液（如0.6 M KCl），4℃短期保存（<24小時）或添加冷凍保護(hù)劑（如10%甘油）后-80℃長期保存。
二、關(guān)鍵影響因素
菌齡與狀態(tài)：對數(shù)生長期的菌絲細(xì)胞壁更易降解。
酶的選擇：
酵母：Zymolyase、Lyticase；
絲狀真菌：裂解酶+纖維素酶混合（如裂解酶Lywallzyme + Cellulase Onozuka R-10）。
滲透壓穩(wěn)定劑：防止原生質(zhì)體破裂，常用山梨醇、蔗糖（濃度需優(yōu)化）。
酶解條件：溫度、pH、時間需根據(jù)菌種調(diào)整，過長會導(dǎo)致細(xì)胞破裂。
三、質(zhì)量控制
活力檢測：臺盼藍(lán)染色（死細(xì)胞呈藍(lán)色）或熒光素二乙酸酯（FDA）染色（活細(xì)胞發(fā)熒光）。
純度評估：顯微鏡觀察碎片殘留量，或檢測上清液中胞內(nèi)酶（如乳酸脫氫酶）泄漏量。
得率計(jì)算：血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體數(shù)量，優(yōu)化酶解條件以提高產(chǎn)量。
四、常見問題與解決
低得率：增加酶濃度、延長酶解時間或調(diào)整預(yù)處理?xiàng)l件。
原生質(zhì)體破裂：檢查滲透壓穩(wěn)定劑濃度，避免劇烈振蕩。
殘留細(xì)胞壁：嘗試混合酶解（如添加幾丁質(zhì)酶）。
五、應(yīng)用示例
遺傳轉(zhuǎn)化：PEG介導(dǎo)DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體。
細(xì)胞融合：聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)不同菌株原生質(zhì)體融合。
細(xì)胞壁再生研究：觀察原生質(zhì)體在固體再生培養(yǎng)基上的壁重建能力。
通過優(yōu)化酶解條件和嚴(yán)格操作，可高效制備高活力真菌原生質(zhì)體，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
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