細(xì)胞培養(yǎng)中的真菌污染的來源與影響及全面預(yù)防策略！
小楊 / 2025-06-18 10:18:22
百歐博偉生物：細(xì)胞培養(yǎng)中遭遇真菌污染，絕對是實驗室里令人頭疼的問題。那種打開培養(yǎng)箱看到漂浮菌絲的心情，我太理解了——不僅意味著實驗中斷，還可能損失珍貴的細(xì)胞系。下面我來系統(tǒng)梳理真菌污染的來源、影響及實用預(yù)防措施：
一、來源：真菌孢子無處不在
1、環(huán)境空氣與灰塵：
實驗室空氣中飄浮著大量真菌孢子，尤其在潮濕、通風(fēng)不良或靠近建筑工地、綠化的環(huán)境中。
人員走動、開關(guān)門、物品移動都會揚起灰塵，攜帶孢子進(jìn)入操作區(qū)。
2、操作人員：
皮膚、毛發(fā)、衣物：人體是重要的真菌攜帶源（如
皮膚癬菌、
酵母菌）。實驗服不潔、頭發(fā)暴露、未戴帽子口罩是常見風(fēng)險點。
呼吸與交談：說話、咳嗽、打噴嚏會噴出含有微生物（包括真菌孢子）的氣溶膠。
不當(dāng)?shù)牟僮髁?xí)慣：手或手套觸碰非無菌表面（如門把手、電話、顯微鏡）后再接觸培養(yǎng)物品。
3、培養(yǎng)箱內(nèi)部環(huán)境：
高濕度：為維持細(xì)胞生長而設(shè)的高濕度環(huán)境（>80%）正是真菌生長的溫床。
水盤污染：培養(yǎng)箱底部用于加濕的水盤若未定期清潔消毒（如使用消毒劑或無菌水），極易滋生霉菌（如
青霉、
曲霉）和
酵母菌。
孢子沉積與擴(kuò)散：污染一旦發(fā)生，孢子可隨氣流在培養(yǎng)箱內(nèi)擴(kuò)散，污染其他培養(yǎng)物。
4、培養(yǎng)基、試劑與耗材：
滅菌不徹底：培養(yǎng)基、胰酶、PBS等液體試劑過濾除菌不完全或保存不當(dāng)（如開蓋時間過長）。
水質(zhì)問題：配制試劑用水（超純水、蒸餾水）儲存系統(tǒng)或管道被污染。
血清污染：個別批次胎牛血清可能在采集或處理過程中被真菌污染。
耗材滅菌失效：培養(yǎng)瓶/皿、離心管、吸頭等滅菌后包裝破損或存放過久。
5、生物安全柜/超凈工作臺：
表面清潔不徹底：工作臺面、內(nèi)壁、移液器、試劑架等未按要求使用適當(dāng)消毒劑（如殺孢子劑）徹底擦拭。
高效過濾器失效或泄漏：無法有效阻隔外部空氣中的孢子。
操作氣流紊亂：手臂頻繁快速進(jìn)出、物品阻擋風(fēng)口、身后人員走動等破壞無菌風(fēng)幕。
6、水浴鍋：
用于預(yù)熱培養(yǎng)基或試劑的水浴鍋是高風(fēng)險區(qū)。溫暖的水體是微生物（包括真菌）的理想繁殖地，尤其未定期換水加消毒劑時。
7、被污染的細(xì)胞系：
引入的細(xì)胞系本身可能攜帶潛伏的、未被檢測到的真菌污染。
交叉污染：處理污染培養(yǎng)物后未徹底清潔即操作其他細(xì)胞。
二、影響：代價高昂的"不速之客"
1、與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)：真菌快速生長消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖、氨基酸等關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞"挨餓"。
2、改變培養(yǎng)環(huán)境：
pH值波動：真菌代謝產(chǎn)生酸性或堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH急劇變化。
耗竭氧氣：大量生長消耗溶解氧，影響細(xì)胞呼吸。
積累毒素：許多真菌分泌對細(xì)胞有毒性的次級代謝產(chǎn)物。
3、物理性破壞：
菌絲纏繞：霉菌菌絲可纏繞、包裹甚至撕裂細(xì)胞。
阻塞孔洞：在過濾系統(tǒng)或細(xì)小管道中生長造成堵塞。
4、抑制細(xì)胞生長與導(dǎo)致死亡：上述因素綜合作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯、形態(tài)異常、活力下降直至大規(guī)模死亡。
5、實驗失敗與數(shù)據(jù)失真：污染培養(yǎng)物無法用于任何可靠的實驗（如藥物篩選、功能研究、蛋白生產(chǎn)），導(dǎo)致時間、精力、昂貴試劑（如血清、因子）的巨大浪費。
6、交叉污染風(fēng)險：處理不當(dāng)極易污染同培養(yǎng)箱內(nèi)其他細(xì)胞、實驗室環(huán)境和設(shè)備。
7、生物安全隱患：某些真菌（如
曲霉）可能對免疫低下人員構(gòu)成機(jī)會性感染風(fēng)險。
三、預(yù)防措施：構(gòu)筑多層防御體系
預(yù)防永遠(yuǎn)勝于治療！構(gòu)建一套"人-機(jī)-料-法-環(huán)"的全面防御體系至關(guān)重要：
1、嚴(yán)格的個人衛(wèi)生與無菌操作規(guī)范：
穿戴整齊：進(jìn)入細(xì)胞房必須穿專用清潔實驗服、戴一次性帽子（覆蓋所有頭發(fā)）、口罩（遮住口鼻）和手套（進(jìn)入安全柜前用75%乙醇消毒）。
行為規(guī)范：盡量減少說話、禁止唱歌/吹口哨，避免快速移動。操作時身體前部盡量少進(jìn)入安全柜開放區(qū)域。
手部消毒：進(jìn)入細(xì)胞房前、接觸任何培養(yǎng)物品前后，嚴(yán)格洗手并用乙醇消毒。
手套管理：進(jìn)入生物安全柜后，用75%乙醇噴灑手套并待干后再操作。接觸潛在污染源（如門把手）后及時更換手套或再次消毒。
培訓(xùn)與意識：所有操作人員必須經(jīng)過嚴(yán)格的無菌操作培訓(xùn)并通過考核。強(qiáng)化污染危害意識。
2、實驗室環(huán)境控制：
獨立空間：細(xì)胞培養(yǎng)實驗室應(yīng)相對獨立，限制人員進(jìn)出。
正壓與空氣過濾：維持細(xì)胞房空氣正壓，安裝高效空氣過濾器（HEPA），定期更換。
清潔消毒：每天用消毒劑清潔地面、臺面。每周或每月進(jìn)行徹底清潔（包括墻面、天花板、設(shè)備表面），使用殺孢子劑（如過氧乙酸消毒劑）。保持環(huán)境整潔、無塵、無雜物。
濕度控制：控制細(xì)胞房整體濕度（理想40%-60%），減少環(huán)境孢子負(fù)荷。
3、生物安全柜/超凈工作臺：
認(rèn)證與維護(hù)：定期（通常每年）進(jìn)行性能認(rèn)證（風(fēng)速、氣流模式、HEPA完整性）。
使用前準(zhǔn)備：每次使用前開啟風(fēng)機(jī)至少10-15分鐘（帶UV的可在操作前開啟UV照射15-30分鐘，但UV不能替代化學(xué)消毒?。?。用75%乙醇徹底擦拭內(nèi)表面（臺面、側(cè)壁、后壁）、所有放入物品（試劑瓶、移液器、支架）外表面。
操作區(qū)管理：工作臺面只放置本次實驗必需物品，分區(qū)明確（潔凈區(qū)、操作區(qū)、污物區(qū)）。避免阻擋前后風(fēng)口。移液器、吸頭盒等放在兩側(cè)靠后位置。
廢棄物處理：廢液缸、廢棄槍頭/管等及時清理出工作區(qū)，避免堆積。工作結(jié)束時立即移出所有物品并徹底清潔臺面。
4、培養(yǎng)箱的維護(hù)與監(jiān)控：
水盤管理：
首選：使用無菌蒸餾水/超純水，并加入專用的無揮發(fā)性、無腐蝕性、廣譜抑菌抑真菌培養(yǎng)箱消毒劑（如銅離子溶液、特定商用消毒劑）。這是最關(guān)鍵措施之一。
次選/嚴(yán)格操作：若使用普通水，必須加入適量消毒劑（如硫酸銅終濃度0.1-0.2g/L），并每周徹底更換、嚴(yán)格清潔消毒水盤和內(nèi)壁。風(fēng)險較高，不推薦。
定期清潔消毒：每月或根據(jù)使用頻率，徹底清潔消毒培養(yǎng)箱內(nèi)腔（擱架、內(nèi)壁、門封條）。取出所有物品后，使用75%乙醇擦拭，必要時使用殺孢子劑。清潔時關(guān)閉CO2，避免消毒劑腐蝕。
溫濕度監(jiān)控：定期校準(zhǔn)溫濕度傳感器。維持濕度穩(wěn)定，避免過高（尤其避免冷凝水）。
減少開門頻率與時間。
獨立培養(yǎng)箱：有條件可為珍貴或高風(fēng)險細(xì)胞設(shè)立專用培養(yǎng)箱。
5、培養(yǎng)基、試劑與耗材管理：
來源可靠：選擇信譽(yù)良好的供應(yīng)商。
無菌操作：在安全柜內(nèi)開瓶、分裝試劑。瓶蓋開啟后朝上放于無菌區(qū)域（如用乙醇擦拭過的移液器支架上）。
分裝使用：大包裝試劑分裝至小體積無菌管，避免反復(fù)凍融主庫存或反復(fù)取用增加污染風(fēng)險。
規(guī)范儲存：按說明書要求儲存（避光、冷藏/冷凍）。定期檢查液體有無渾濁、沉淀。
水浴預(yù)熱：
將裝有培養(yǎng)基/試劑的瓶子完全密封（旋緊瓶蓋，最好用封口膜包裹）后再放入水浴鍋。
水浴鍋水必須定期（最好每天）更換并加入消毒劑（如0.1% 專用水浴鍋消毒劑）。
取出后立即用75%乙醇徹底擦拭瓶子外表面再放入安全柜。
強(qiáng)烈推薦使用干式恒溫器替代水浴鍋。
耗材：使用無菌、一次性耗材。檢查包裝完整性，過期勿用。滅菌玻璃器皿應(yīng)徹底清潔干燥，在有效期內(nèi)使用。
6、細(xì)胞操作規(guī)范：
來源清晰：引入新細(xì)胞系需進(jìn)行嚴(yán)格的支原體、真菌、細(xì)菌檢測。
定期檢查：每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，留意培養(yǎng)基是否渾濁、有無菌絲、酵母菌團(tuán)或異常pH變化。
生物安全柜內(nèi)操作：所有涉及開放培養(yǎng)皿/瓶的操作（傳代、換液、加藥）必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
專用移液器與吸頭：盡量為不同細(xì)胞系配備專用移液器，至少確保吸頭不交叉使用。
及時處理污染：一旦發(fā)現(xiàn)污染，立即將培養(yǎng)物密封（用封口膜或自封袋），移出培養(yǎng)箱和安全柜，按生物危害廢物處理規(guī)程（高壓滅菌）處置。徹底清潔污染區(qū)域（培養(yǎng)箱擱架位置、安全柜臺面）和接觸物品（移液器），使用殺孢子劑。
7、避免濫用抗生素：
常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)不應(yīng)在培養(yǎng)基中添加抗真菌抗生素。其作用有限（對許多霉菌效果差），可能掩蓋低水平污染，誘導(dǎo)耐藥性，并對某些細(xì)胞有毒性。僅在特殊需求（如原代培養(yǎng)初期）且了解風(fēng)險時短期使用。
總結(jié)
真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)實驗室的主要威脅之一，其孢子來源廣泛且難以徹底消除。污染后果嚴(yán)重，導(dǎo)致資源浪費、實驗失敗和潛在風(fēng)險。最有效的策略是建立并嚴(yán)格執(zhí)行以"預(yù)防為主"的多層次防御體系：
強(qiáng)化人員培訓(xùn)與無菌意識（最關(guān)鍵）。
保證生物安全柜性能良好并正確使用和維護(hù)。
嚴(yán)格管理和維護(hù)培養(yǎng)箱（特別是水盤）。
規(guī)范操作培養(yǎng)基、試劑和耗材（尤其水浴環(huán)節(jié)）。
保持實驗室環(huán)境清潔、有序、受控。
對新引入細(xì)胞系進(jìn)行檢測，對現(xiàn)有細(xì)胞定期仔細(xì)觀察。
一旦發(fā)現(xiàn)污染，立即、安全、徹底地處置。
保持警惕、注重細(xì)節(jié)并嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，是最大限度降低真菌污染風(fēng)險、保障細(xì)胞培養(yǎng)實驗順利進(jìn)行和數(shù)據(jù)可靠性的根本之道。每次實驗前花幾分鐘做好清潔和準(zhǔn)備工作，往往能省下數(shù)周甚至數(shù)月的重復(fù)工作，值得你投入這份耐心！
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