培養(yǎng)基與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)的具體影響有哪些？
小楊 / 2025-06-23 10:07:41
百歐博偉生物：檢測(cè)水體中的細(xì)菌總數(shù)（通常指異養(yǎng)菌平板計(jì)數(shù)）是評(píng)價(jià)水質(zhì)衛(wèi)生狀況和微生物污染程度的重要指標(biāo)。培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間是影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和可比性的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素。以下是它們的具體影響：
一、培養(yǎng)基的影響
1、營(yíng)養(yǎng)成分與豐富度：
高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（如營(yíng)養(yǎng)瓊脂/肉膏瓊脂）：更適合富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)菌或生長(zhǎng)快速的細(xì)菌。使用這類培養(yǎng)基可能導(dǎo)致：
低估貧營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量：許多水體中的原生細(xì)菌（特別是清潔水源中的）是貧營(yíng)養(yǎng)型或寡營(yíng)養(yǎng)型，它們?cè)跔I(yíng)養(yǎng)過于豐富的培養(yǎng)基上可能生長(zhǎng)緩慢、不生長(zhǎng)甚至死亡（營(yíng)養(yǎng)休克）。
高估可培養(yǎng)菌數(shù)？：在污染水體中，可能促進(jìn)某些快速生長(zhǎng)的細(xì)菌過度繁殖，形成更大菌落，但未必能更全面地反映所有可培養(yǎng)菌。
低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：專門設(shè)計(jì)用于培養(yǎng)水體等環(huán)境樣本中的貧營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌。它們通常含有較低濃度的碳源、氮源和微量元素，更接近自然環(huán)境條件。使用這類培養(yǎng)基通常：
獲得更高的菌落計(jì)數(shù)：因?yàn)樗苤С指喾N類的貧營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)，更真實(shí)地反映水體中可培養(yǎng)的異養(yǎng)菌總數(shù)。
菌落更小、生長(zhǎng)更慢：需要更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間才能形成可見菌落。
2、選擇性：
不同培養(yǎng)基的配方（碳源、氮源、維生素、生長(zhǎng)因子、緩沖鹽、抑制劑等）決定了它能支持哪些類群的細(xì)菌生長(zhǎng)。
沒有一種“萬能”培養(yǎng)基能培養(yǎng)出所有細(xì)菌。水體中通常包含多種生理類型（貧營(yíng)養(yǎng)、富營(yíng)養(yǎng)、嗜冷、嗜溫、需氧、兼性厭氧等）的細(xì)菌。
選擇不同的培養(yǎng)基，必然會(huì)導(dǎo)致最終計(jì)數(shù)的細(xì)菌類群和數(shù)量不同。例如，含鹽培養(yǎng)基會(huì)抑制非嗜鹽菌，而含特定抗生素的培養(yǎng)基會(huì)選擇性抑制某些細(xì)菌。
3、pH 和滲透壓：
培養(yǎng)基的初始pH和滲透壓會(huì)影響細(xì)菌的復(fù)蘇和生長(zhǎng)。偏離細(xì)菌最適范圍會(huì)抑制其生長(zhǎng)，導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低。
4、瓊脂濃度：
影響培養(yǎng)基的硬度，進(jìn)而影響菌落的擴(kuò)散性。濃度過低可能導(dǎo)致菌落蔓延，難以計(jì)數(shù)。
結(jié)論：培養(yǎng)基的選擇直接決定了實(shí)驗(yàn)中“可培養(yǎng)”的細(xì)菌范圍。 使用高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基會(huì)嚴(yán)重低估清潔水體中的細(xì)菌總數(shù)，而低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是當(dāng)前國(guó)際推薦用于飲用水和較清潔水體HPC檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，能提供更接近實(shí)際可培養(yǎng)菌數(shù)的結(jié)果。對(duì)于污染嚴(yán)重的水體，營(yíng)養(yǎng)瓊脂也可能適用，但結(jié)果不可與使用R2A的結(jié)果直接比較。
二、培養(yǎng)時(shí)間的影響
1、細(xì)菌生長(zhǎng)速度的差異：
水體中的細(xì)菌種類繁多，其世代時(shí)間（分裂一次所需時(shí)間）差異巨大。有些細(xì)菌在適宜條件下幾十分鐘就能分裂一次（快生菌），而貧營(yíng)養(yǎng)菌或受傷的細(xì)菌可能需要幾天甚至幾周才能形成可見菌落（慢生菌）。
固定的短培養(yǎng)時(shí)間（如24或48小時(shí)）只能計(jì)數(shù)生長(zhǎng)最快的細(xì)菌。
2、菌落形成所需時(shí)間：
單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞或小菌團(tuán)需要經(jīng)歷復(fù)蘇、適應(yīng)、生長(zhǎng)和分裂多個(gè)階段，才能增殖到肉眼可見的大?。ㄍǔ?gt;0.1 mm）。
貧營(yíng)養(yǎng)菌、受傷菌或處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞，這個(gè)適應(yīng)和啟動(dòng)生長(zhǎng)的過程可能非常長(zhǎng)。
3、對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的直接影響：
培養(yǎng)時(shí)間過短（如24-48小時(shí)）：
嚴(yán)重低估總菌數(shù)：絕大多數(shù)貧營(yíng)養(yǎng)菌和許多生長(zhǎng)較慢的細(xì)菌無法形成可見菌落。
結(jié)果主要反映快速生長(zhǎng)的富營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌。
延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間（如5天、7天甚至更長(zhǎng)）：
顯著提高計(jì)數(shù)結(jié)果：越來越多的慢生菌有足夠時(shí)間形成菌落。
更全面地反映可培養(yǎng)菌群：更接近水體中實(shí)際可復(fù)蘇和培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)。
可能引入新問題：
蔓延菌落：某些細(xì)菌在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后會(huì)擴(kuò)散生長(zhǎng)，覆蓋其他菌落或整個(gè)平板，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
菌落融合：相鄰菌落長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)可能融合在一起，被計(jì)為一個(gè)菌落。
培養(yǎng)基干燥：長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)可能導(dǎo)致平板失水干燥，影響后續(xù)細(xì)菌生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致菌落死亡。
次生代謝影響：先長(zhǎng)出的菌落可能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制周圍菌落生長(zhǎng)。
結(jié)論：培養(yǎng)時(shí)間不足是導(dǎo)致HPC計(jì)數(shù)嚴(yán)重低估（尤其是清潔水體）的最主要原因之一。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于獲得更準(zhǔn)確的總數(shù)至關(guān)重要。
三、標(biāo)準(zhǔn)方法中的折衷
考慮到實(shí)際操作（時(shí)效性、防止蔓延等）和結(jié)果的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)方法通常會(huì)規(guī)定一個(gè)折衷的培養(yǎng)時(shí)間。
例如：
使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時(shí)間常為 48 ± 3小時(shí) (35-37°C)。
使用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基時(shí)，推薦培養(yǎng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)。例如：
美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)方法：R2A瓊脂，5-7天，28°C。
中國(guó)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》（GB/T 5750.12）：R2A瓊脂， 培養(yǎng)7天 (28°C 或 36°C ±1°C)。
這種延長(zhǎng)時(shí)間（5-7天）是為了最大程度地捕獲水體中生長(zhǎng)緩慢的貧營(yíng)養(yǎng)菌，同時(shí)盡量避免因時(shí)間過長(zhǎng)帶來的蔓延等問題。
四、總結(jié)與關(guān)鍵點(diǎn)
相互作用：培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間是緊密關(guān)聯(lián)的。低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通常需要更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間才能獲得有意義的計(jì)數(shù)。
低估是常態(tài)：無論選擇何種培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間，平板計(jì)數(shù)法都只能檢測(cè)到能在所選條件下生長(zhǎng)并形成菌落的那部分細(xì)菌（可培養(yǎng)的異養(yǎng)菌），通常只占環(huán)境樣品中總細(xì)菌（通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)）的極小一部分（<1%）。培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間的選擇主要影響這個(gè)“可培養(yǎng)部分”的檢出比例和組成。
標(biāo)準(zhǔn)化的必要性：為了結(jié)果的可比性（不同實(shí)驗(yàn)室間、不同時(shí)間點(diǎn)），必須嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（溫度、時(shí)間）進(jìn)行操作。使用不同的培養(yǎng)基或改變培養(yǎng)時(shí)間，得到的結(jié)果絕對(duì)不可直接比較。
培養(yǎng)基選擇優(yōu)先：對(duì)于飲用水及較清潔水體，使用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是獲得更準(zhǔn)確、更高HPC計(jì)數(shù)的前提。
培養(yǎng)時(shí)間關(guān)鍵：在選擇了合適的低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基后，保證足夠的培養(yǎng)時(shí)間（通常5-7天）是準(zhǔn)確計(jì)數(shù)（尤其是包含貧營(yíng)養(yǎng)菌）的關(guān)鍵?？s短時(shí)間會(huì)嚴(yán)重低估。
因此，在設(shè)計(jì)或解讀水體細(xì)菌總數(shù)（HPC）檢測(cè)結(jié)果時(shí)，必須明確標(biāo)注所使用的具體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（溫度和時(shí)間），否則結(jié)果將失去可比性和實(shí)際意義。選擇合適的培養(yǎng)基（推薦低營(yíng)養(yǎng)）并給予足夠長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間（5-7天），是盡可能接近真實(shí)“可培養(yǎng)異養(yǎng)菌總數(shù)”的必要條件。
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