緩沖動(dòng)力硝酸鹽生化管的核心原理與使用方法及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-07-03 09:17:10
百歐博偉生物：緩沖動(dòng)力硝酸鹽生化管是一種用于微生物學(xué)檢測(cè)的專用培養(yǎng)基，主要用于鑒定細(xì)菌是否具有還原硝酸鹽（NO??）為亞硝酸鹽（NO??）或進(jìn)一步還原為氮?dú)猓∟?）或其他氮化合物的能力。這項(xiàng)檢測(cè)是微生物鑒定（尤其是腸桿菌科和非發(fā)酵菌）中的一項(xiàng)重要生化試驗(yàn)。
一、核心原理：
提供硝酸鹽底物：培養(yǎng)基中含有已知濃度的硝酸鉀，作為細(xì)菌還原作用的底物。
提供營(yíng)養(yǎng)與緩沖環(huán)境：培養(yǎng)基包含蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，支持細(xì)菌生長(zhǎng)。更重要的是，它含有緩沖系統(tǒng)（通常是磷酸鹽緩沖液），這是名稱中“緩沖動(dòng)力”的來(lái)源。
緩沖作用：維持培養(yǎng)基pH相對(duì)穩(wěn)定。細(xì)菌在代謝過(guò)程中可能產(chǎn)酸或產(chǎn)堿，緩沖液能中和這些變化，防止pH劇烈波動(dòng)影響酶的活性或?qū)е录訇幮越Y(jié)果。
動(dòng)力檢測(cè)（間接）：“動(dòng)力”在此處并非直接觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性，而是指細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)擴(kuò)散能力。該培養(yǎng)基是半固體形式（瓊脂含量約為0.3%-0.4%）。具有鞭毛能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，可以從穿刺線向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)（呈云霧狀或彌漫性生長(zhǎng)）；無(wú)鞭毛不能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，則主要沿穿刺線生長(zhǎng)（呈線狀生長(zhǎng)）。生長(zhǎng)模式有助于輔助鑒定。
檢測(cè)亞硝酸鹽（初步還原）：
如果細(xì)菌能將硝酸鹽（NO??）還原為亞硝酸鹽（NO??），當(dāng)加入檢測(cè)試劑（通常是對(duì)氨基苯磺酸和α-萘胺的混合液，稱為硝酸鹽試劑或格里斯試劑）后，NO??會(huì)與試劑反應(yīng)生成紅色偶氮化合物（重氮反應(yīng)）。這是陽(yáng)性反應(yīng)（+），表明細(xì)菌具有還原NO??到NO??的能力。
檢測(cè)氮?dú)饣蚱渌a(chǎn)物（完全還原）：
有些細(xì)菌不僅能把NO??還原為NO??，還能進(jìn)一步將NO??還原為氮?dú)猓∟?）、一氧化二氮（N?O）、氨（NH?）等其他氮化合物。這些產(chǎn)物無(wú)法與格里斯試劑反應(yīng)顯紅色。
鋅粉驗(yàn)證：如果在加入格里斯試劑后不顯紅色（陰性反應(yīng)），需要添加鋅粉進(jìn)行驗(yàn)證。
鋅粉的作用：鋅粉是一種強(qiáng)還原劑。如果培養(yǎng)基中仍有未被細(xì)菌還原的硝酸鹽（NO??）存在，鋅粉能將其化學(xué)還原為亞硝酸鹽（NO??）。
結(jié)果判讀：
加入鋅粉后顯紅色：說(shuō)明原始培養(yǎng)基中仍有NO??存在，細(xì)菌沒(méi)有還原它（即細(xì)菌硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性）。
加入鋅粉后仍不顯紅色：說(shuō)明原始培養(yǎng)基中的NO??已被細(xì)菌完全還原成了NO??以外的其他產(chǎn)物（如N?）。這是陽(yáng)性反應(yīng)（+），表明細(xì)菌具有將硝酸鹽完全還原（或稱“徹底還原”）的能力。
二、使用方法：
接種：
用無(wú)菌接種針挑取待測(cè)細(xì)菌的純培養(yǎng)菌落。
以穿刺方式接種到緩沖動(dòng)力硝酸鹽生化管的培養(yǎng)基中，穿刺深度約為管深的1/3到1/2。
注意：穿刺后，沿原穿刺路徑小心將針抽出，避免過(guò)度攪動(dòng)培養(yǎng)基。
培養(yǎng)：
將接種后的生化管置于合適的溫度（通常為35-37°C）下進(jìn)行有氧培養(yǎng)。
培養(yǎng)時(shí)間一般為18-24小時(shí)。某些生長(zhǎng)緩慢的菌株可能需要培養(yǎng)至48小時(shí)。
觀察動(dòng)力：培養(yǎng)后，首先在光線充足處觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)模式：
沿穿刺線生長(zhǎng)（線狀）：通常表示無(wú)動(dòng)力（不運(yùn)動(dòng)）。
從穿刺線向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)（云霧狀、彌漫狀）：通常表示有動(dòng)力（運(yùn)動(dòng)）。
檢測(cè)硝酸鹽還原（加試劑）：
取出培養(yǎng)后的生化管。
向管內(nèi)加入硝酸鹽還原試劑A（對(duì)氨基苯磺酸）和硝酸鹽還原試劑B（α-萘胺）各4-5滴。
輕輕搖動(dòng)試管，使試劑與培養(yǎng)基充分混合。
立即（通常在1-2分鐘內(nèi)）觀察顏色變化：
出現(xiàn)紅色或粉紅色：陽(yáng)性（+）。表明細(xì)菌將硝酸鹽還原成了亞硝酸鹽。
無(wú)顏色變化（保持試劑顏色或培養(yǎng)基原色）：暫定陰性。需要進(jìn)行下一步驗(yàn)證。
驗(yàn)證試驗(yàn)（加鋅粉 - 僅當(dāng)?shù)?步不顯色時(shí)進(jìn)行）：
向未顯色的試管內(nèi)加入少量鋅粉（約一接種環(huán)的量）。
再次輕輕搖動(dòng)試管。
立即（通常在1-2分鐘內(nèi)）觀察顏色變化：
出現(xiàn)紅色或粉紅色：陰性（-）。鋅粉將殘留的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，證明細(xì)菌本身沒(méi)有還原硝酸鹽。
仍無(wú)顏色變化：陽(yáng)性（+）。表明細(xì)菌已將硝酸鹽完全還原成了亞硝酸鹽以外的產(chǎn)物（如N?），因此即使加入鋅粉也無(wú)硝酸鹽可供還原顯色。
三、結(jié)果總結(jié)：
加入試劑A+B后的顏色 加入鋅粉后的顏色 結(jié)果判讀 意義
紅色/粉紅色 無(wú)需加鋅粉 陽(yáng)性 (+) 細(xì)菌將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽
無(wú)顏色變化 紅色/粉紅色 陰性 (-) 細(xì)菌未還原硝酸鹽
無(wú)顏色變化 無(wú)顏色變化 陽(yáng)性 (+) 細(xì)菌將硝酸鹽完全還原成其他產(chǎn)物（如N?）
四、注意事項(xiàng)：
無(wú)菌操作：接種和加試劑時(shí)務(wù)必遵守?zé)o菌操作規(guī)程。
試劑質(zhì)量與保存：硝酸鹽試劑（A和B）應(yīng)新鮮配制或按要求保存（通常避光冷藏），避免失效。鋅粉應(yīng)干燥保存。
立即觀察：顏色反應(yīng)（特別是加入鋅粉后）應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（1-2分鐘）觀察，放置過(guò)久顏色可能消退或出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。
培養(yǎng)時(shí)間：確保足夠的培養(yǎng)時(shí)間。培養(yǎng)不足可能導(dǎo)致假陰性。對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌，應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至48小時(shí)后再檢測(cè)。
對(duì)照試驗(yàn)：建議每次試驗(yàn)時(shí)同時(shí)設(shè)置已知陽(yáng)性菌（如
大腸埃希菌）和已知陰性菌（如
醋酸鈣不動(dòng)桿菌）作為對(duì)照，以確保試劑和培養(yǎng)基有效，操作正確。
試劑添加順序：必須先加A液再加B液，或者使用A/B混合液。
安全：α-萘胺有潛在致癌性，操作時(shí)應(yīng)戴手套，在通風(fēng)櫥或安全環(huán)境下進(jìn)行。濃鹽酸（有時(shí)用于配制試劑）具有強(qiáng)腐蝕性，需小心操作。
動(dòng)力觀察：觀察動(dòng)力時(shí)，輕輕拿起試管，避免劇烈晃動(dòng)破壞生長(zhǎng)模式。最好在透光良好的背景下觀察。
五、應(yīng)用：
該試驗(yàn)廣泛用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室、環(huán)境微生物檢測(cè)、食品和水質(zhì)檢測(cè)等領(lǐng)域，是鑒定以下細(xì)菌的重要指標(biāo)之一：
厭氧菌：某些厭氧菌鑒定方案中也包含硝酸鹽還原試驗(yàn)。
通過(guò)結(jié)合動(dòng)力觀察和硝酸鹽還原結(jié)果（是否產(chǎn)亞硝酸鹽或完全還原），可以更準(zhǔn)確地輔助細(xì)菌的鑒定。
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