大腸菌群培養(yǎng)基的檢驗(yàn)原理和使用方法及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-07-04 09:31:25
大腸菌群是衛(wèi)生微生物學(xué)中一類重要的指示菌，主要用于評(píng)估食品、飲用水、環(huán)境樣品等的衛(wèi)生狀況。其檢驗(yàn)通常采用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法。最常用的培養(yǎng)基是月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯和煌綠乳糖膽鹽肉湯，以及用于分離鑒別的伊紅美藍(lán)瓊脂。
一、核心檢驗(yàn)原理：
1、選擇性生長(zhǎng)：
膽鹽或表面活性劑：抑制大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)（如
芽孢桿菌、
葡萄球菌、
鏈球菌等），但對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌（包括
大腸菌群）抑制作用較弱或沒(méi)有抑制作用。
煌綠（亮綠）：一種抑菌染料，進(jìn)一步抑制非目標(biāo)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分非大腸菌群的革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)。
2、指示發(fā)酵：
乳糖作為唯一碳源：培養(yǎng)基中含有乳糖作為主要可發(fā)酵糖類。
酸堿指示劑（如溴甲酚紫、中性紅）：大腸菌群若能發(fā)酵乳糖，就會(huì)產(chǎn)酸（主要是乳酸、乙酸等）。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降，導(dǎo)致酸堿指示劑變色。
產(chǎn)氣檢測(cè)：
大腸菌群發(fā)酵乳糖時(shí)還會(huì)產(chǎn)生氣體（主要是CO?和H?）。在液體培養(yǎng)基中，通常使用倒置的杜漢氏小管來(lái)收集產(chǎn)生的氣體。小管頂部出現(xiàn)氣泡（無(wú)論大小）即為產(chǎn)氣陽(yáng)性。
3、驗(yàn)證與鑒定（確證試驗(yàn)）：
初發(fā)酵陽(yáng)性的樣品（產(chǎn)酸產(chǎn)氣），需要進(jìn)一步接種到鑒別性固體培養(yǎng)基上進(jìn)行驗(yàn)證。
伊紅美藍(lán)瓊脂：
大腸菌群（特別是典型的大腸桿菌）在EMB上會(huì)形成具有金屬光澤的深紫色或紫黑色菌落。這是因?yàn)樗鼈兡軓?qiáng)烈發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使伊紅和美藍(lán)結(jié)合并沉淀在菌落表面。其他非大腸菌群的乳糖發(fā)酵菌（如
產(chǎn)氣腸桿菌）通常形成棕色或粉紅色、無(wú)金屬光澤的菌落。非乳糖發(fā)酵菌形成無(wú)色或淺琥珀色菌落。
EC肉湯：在44.5±0.2°C下培養(yǎng)，用于檢測(cè)耐熱大腸菌群（主要是
大腸桿菌）。產(chǎn)氣為陽(yáng)性。
二、常用培養(yǎng)基及使用方法（以多管發(fā)酵法為例）：
用途：大腸菌群檢驗(yàn)的初發(fā)酵（推定試驗(yàn)）。
原理：月桂基硫酸鹽抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，乳糖作為發(fā)酵底物，溴甲酚紫作為酸堿指示劑。
成分（典型）：胰蛋白胨、乳糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、月桂基硫酸鈉、溴甲酚紫。
使用方法：
制備：按說(shuō)明書(shū)稱量，加熱溶解于蒸餾水中，分裝于帶杜漢氏小管的試管（如10mL/管）。121°C高壓滅菌15分鐘。
接種：將不同稀釋度的樣品勻液（或原液）接種于LST管中（如接種1mL于10mL LST管）。
培養(yǎng)：35±0.5°C培養(yǎng)24±2小時(shí)。
觀察：檢查杜漢氏小管內(nèi)是否有氣泡（產(chǎn)氣）以及培養(yǎng)基顏色是否由紫色變?yōu)辄S色（產(chǎn)酸）。
結(jié)果判定：產(chǎn)酸（變黃）且產(chǎn)氣（小管內(nèi)有氣泡）的管為初發(fā)酵陽(yáng)性（推定陽(yáng)性）。僅產(chǎn)酸不產(chǎn)氣或僅產(chǎn)氣不產(chǎn)酸（較少見(jiàn)）通常視為陰性。24小時(shí)未產(chǎn)氣的管可繼續(xù)培養(yǎng)至48小時(shí)再觀察一次。
用途：大腸菌群檢驗(yàn)的復(fù)發(fā)酵（確證試驗(yàn)）。用于驗(yàn)證LST初發(fā)酵陽(yáng)性的結(jié)果。
原理：膽鹽和煌綠提供更強(qiáng)的選擇性，抑制非大腸菌群細(xì)菌。乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣為確證陽(yáng)性。
成分（典型）：蛋白胨、乳糖、牛膽鹽、煌綠、蒸餾水。
使用方法：
制備：按說(shuō)明書(shū)稱量溶解，分裝于帶杜漢氏小管的試管（如10mL/管）。121°C高壓滅菌15分鐘（注意煌綠遇熱不穩(wěn)定，滅菌溫度和時(shí)間需嚴(yán)格控制）。
接種：用接種環(huán)從初發(fā)酵陽(yáng)性（LST產(chǎn)酸產(chǎn)氣）的試管中取培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)種到BGLB肉湯管中。
培養(yǎng)：35±0.5°C培養(yǎng)48±2小時(shí)。
觀察：檢查產(chǎn)氣情況（杜漢氏小管內(nèi)有氣泡）。
結(jié)果判定：48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)氣的BGLB管報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性（確證陽(yáng)性）。不產(chǎn)氣為陰性。
用途：大腸菌群（尤其是
大腸桿菌）的分離培養(yǎng)和鑒別。常用于平板計(jì)數(shù)法或作為確證試驗(yàn)的一部分。
原理：伊紅和美藍(lán)作為指示劑。強(qiáng)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的大腸菌群（尤其大腸桿菌）使染料結(jié)合沉淀，形成帶金屬光澤的深紫色/紫黑色菌落。弱發(fā)酵菌形成棕色/粉紅色菌落。非發(fā)酵菌形成無(wú)色菌落。
成分（典型）：蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、瓊脂、伊紅Y、美藍(lán)。
使用方法：
制備：按說(shuō)明書(shū)稱量，煮沸溶解于蒸餾水（避免過(guò)度加熱），冷卻至約45-50°C，傾注無(wú)菌平板。
接種：劃線或涂布接種可疑菌落或樣品稀釋液。
培養(yǎng)：35±0.5°C培養(yǎng)18-24小時(shí)。
觀察：挑取具有典型金屬光澤的深紫色或紫黑色菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢（應(yīng)為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌）和生化確證試驗(yàn)。
結(jié)果判定：典型菌落形態(tài)是鑒別的初步依據(jù)，需結(jié)合鏡檢和生化試驗(yàn)最終確認(rèn)是否為大腸菌群（特別是
大腸桿菌）。
三、總結(jié)流程（多管發(fā)酵法示例）：
1、樣品處理與稀釋：制備樣品勻液及適當(dāng)稀釋度。
2、初發(fā)酵（推定試驗(yàn) - LST）：
接種不同稀釋度樣品于LST管。
35°C培養(yǎng)24±2小時(shí)（48小時(shí)再觀察）。
記錄產(chǎn)酸（變黃）且產(chǎn)氣（氣泡）的管數(shù)。
3、復(fù)發(fā)酵（確證試驗(yàn) - BGLB）：
從所有產(chǎn)酸產(chǎn)氣的LST管中取培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)種到BGLB管。
35°C培養(yǎng)48±2小時(shí)。
記錄產(chǎn)氣（氣泡）的BGLB管數(shù)。
4、報(bào)告結(jié)果（MPN法）：根據(jù)初發(fā)酵接種的稀釋度和確證陽(yáng)性的BGLB管數(shù)，查最可能數(shù)表，報(bào)告樣品中大腸菌群的MPN值（單位如：MPN/g或MPN/mL）。
四、重要注意事項(xiàng)：
無(wú)菌操作：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程。
溫度控制：培養(yǎng)箱溫度必須精確控制在規(guī)定范圍內(nèi)（±0.5°C）。
杜漢氏小管觀察：小管內(nèi)任何體積的氣泡都視為產(chǎn)氣陽(yáng)性。傾斜試管有助于觀察微小氣泡。
確證試驗(yàn)的必要性：初發(fā)酵陽(yáng)性僅表示“可疑”，必須經(jīng)過(guò)復(fù)發(fā)酵（BGLB）或平板分離（EMB）等確證試驗(yàn)才能報(bào)告大腸菌群陽(yáng)性。
標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：不同國(guó)家、行業(yè)（食品、水、藥品）有具體的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。必須嚴(yán)格遵循所執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的具體培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、時(shí)間和判定方法。
生物安全：處理可能含有病原微生物的樣品時(shí)，應(yīng)在相應(yīng)級(jí)別的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并做好個(gè)人防護(hù)。
理解培養(yǎng)基的原理是正確使用和解讀結(jié)果的關(guān)鍵。通過(guò)選擇性抑制非目標(biāo)菌，利用目標(biāo)菌的特定代謝特性（發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣）和指示系統(tǒng)（顏色變化、產(chǎn)氣收集），可以有效地檢測(cè)和計(jì)數(shù)
大腸菌群。
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