凝結芽孢桿菌計數(shù)培養(yǎng)基的原理與使用方法及操作步驟！
小楊 / 2025-07-05 09:52:05
凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）計數(shù)通常使用特定的選擇性培養(yǎng)基，最常用的是 TSC 培養(yǎng)基或其改良版本。該培養(yǎng)基的原理在于利用目標菌的生理特性（特別是其芽孢的耐熱性和代謝特性）來抑制雜菌并促進目標菌生長。
一、原理
芽孢耐熱性：凝結芽孢桿菌能形成耐熱的芽孢。樣品經(jīng)過適當?shù)臒崽幚恚ㄈ?80°C 或 85°C 水?。┛梢詺⑺罉悠分薪^大多數(shù)的營養(yǎng)細胞（包括其他非芽孢菌和部分不耐熱的芽孢菌），而凝結芽孢桿菌的芽孢能存活下來。
亞硫酸鹽還原能力：凝結芽孢桿菌在厭氧條件下生長時，能將培養(yǎng)基中的亞硫酸鹽還原成硫化物。
黑色沉淀形成：產(chǎn)生的硫化物與培養(yǎng)基中的鐵鹽反應，生成不溶性的黑色硫化亞鐵（FeS）沉淀。這是識別目標菌落最關鍵的標志。
選擇性抑制：
D-環(huán)絲氨酸（D-Cycloserine）：這是TSC培養(yǎng)基的核心選擇性成分。它是一種抗生素，能有效抑制絕大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌（包括其他常見的芽孢桿菌如
蠟樣芽孢桿菌）的營養(yǎng)細胞生長。但凝結芽孢桿菌的芽孢對D-環(huán)絲氨酸具有相對抗性，能在其存在下萌發(fā)并生長。
亞硫酸鹽：除了作為指示系統(tǒng)的底物外，一定濃度的亞硫酸鹽對部分雜菌也有一定的抑制作用。
熱處理：如前所述，預先熱處理樣品是極其重要的一步選擇性措施，極大地降低了背景雜菌的數(shù)量。
總結原理：通過熱處理殺死營養(yǎng)細胞，利用D-環(huán)絲氨酸選擇性抑制絕大多數(shù)殘留或可能污染的雜菌（尤其是其他芽孢桿菌），在厭氧條件下培養(yǎng)后，凝結芽孢桿菌的芽孢萌發(fā)、生長，并通過還原亞硫酸鹽產(chǎn)生黑色硫化亞鐵沉淀，形成特征性的黑色菌落（通常帶有黑色暈環(huán)或整個菌落變黑），從而進行計數(shù)。
二、使用方法 (基于 GB 4789.14-2014 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗 附錄B 凝結芽孢桿菌的計數(shù))
重要提示：具體操作請務必遵循你所執(zhí)行的最新版本國家標準、行業(yè)標準或藥典規(guī)定。細節(jié)（如稀釋液、熱處理溫度/時間、培養(yǎng)時間）可能因標準更新或具體應用（食品、藥品、益生菌產(chǎn)品）而略有不同。
主要材料與試劑
TSC 培養(yǎng)基基礎：含胰酪胨、大豆胨、酵母浸粉、亞硫酸鈉、檸檬酸鐵銨等。
D-環(huán)絲氨酸溶液：按標準要求濃度配制（通常終濃度為400mg/L）。
無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液：用于樣品稀釋。
無菌平皿、移液管/移液器及槍頭、均質(zhì)袋/均質(zhì)杯、水浴鍋、厭氧培養(yǎng)裝置（如厭氧罐/袋+產(chǎn)氣包）、恒溫培養(yǎng)箱等。
操作步驟
樣品制備與稀釋：
無菌稱取或量取一定量（通常25g或25mL）樣品。
加入適量的無菌稀釋液，在均質(zhì)器中充分均質(zhì)1-2分鐘，制成1:10的樣品勻液。
用無菌移液管或移液器吸取1:10勻液1mL，加入9mL無菌稀釋液中，充分混勻，制成1:100的稀釋液。
按此方法，根據(jù)需要制備一系列十倍遞增稀釋度。選擇2-3個適宜稀釋度進行后續(xù)操作。
熱處理 (關鍵步驟)：
將每個選定的稀釋度樣品勻液（注意：是稀釋后的勻液，不是原始樣品）置于80°C ± 1°C 或 85°C ± 1°C（具體溫度依據(jù)所執(zhí)行的標準）的水浴中。
精確計時加熱 10分鐘。此步驟殺死營養(yǎng)細胞，保留凝結芽孢桿菌芽孢。
立即將處理后的樣品勻液冷卻至室溫（如置于冰水浴中）。
傾注平板：
無菌操作，吸取熱處理并冷卻后的各稀釋度樣品勻液1mL，分別加入無菌平皿中。
傾注TSC培養(yǎng)基：
將制備好的TSC基礎培養(yǎng)基融化并冷卻至45-50°C。
臨用前，按標準要求加入適量過濾除菌的D-環(huán)絲氨酸溶液，輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。
立即將約15-20mL含D-環(huán)絲氨酸的TSC培養(yǎng)基傾注于每個已加入樣液的平皿中。
小心旋轉平皿，使樣液與培養(yǎng)基充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡。靜置待其凝固。
厭氧培養(yǎng)：
待瓊脂完全凝固后，將平板倒置。
放入?yún)捬跖囵B(yǎng)裝置（如厭氧罐或厭氧袋）中。
按照厭氧裝置的要求（通常是加入產(chǎn)氣袋或使用氣體置換法）創(chuàng)造厭氧環(huán)境。
將厭氧裝置置于 36°C ± 1°C 的恒溫培養(yǎng)箱中。
培養(yǎng) 48小時 ± 2小時。
菌落計數(shù)：
培養(yǎng)結束后，取出平板。
選擇菌落數(shù)在15-150 CFU之間的平板進行計數(shù)（若所有稀釋度均小于15，則記錄最低稀釋度的菌落數(shù)；若所有稀釋度均大于150，則記錄最高稀釋度的菌落數(shù)或記為“多不可計”）。
目標菌落特征：凝結芽孢桿菌在TSC培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黑色或棕黑色菌落，菌落周圍通常有黑色沉淀環(huán)（暈環(huán)），有時整個菌落呈黑色。這是基于其還原亞硫酸鹽產(chǎn)生FeS沉淀的特性。
注意：計數(shù)時，只計數(shù)符合上述典型特征的黑色（帶暈環(huán)）菌落。非黑色的菌落通常是雜菌或非目標菌，不應計數(shù)。
結果計算與報告：
根據(jù)計數(shù)結果和相應的稀釋倍數(shù)，計算每克（或每毫升）樣品中凝結芽孢桿菌的數(shù)量（CFU/g 或 CFU/mL）。
報告結果時，通常以科學計數(shù)法表示（如 1.5 × 10? CFU/g）。
三、關鍵注意事項
標準依據(jù)：嚴格遵循你所執(zhí)行的最新有效標準。溫度、時間、培養(yǎng)基配方、D-環(huán)絲氨酸濃度等細節(jié)都可能隨標準更新而變化。
熱處理：溫度（80°C 或 85°C）和時間（10分鐘）必須精確控制。溫度過低或時間過短無法有效殺死營養(yǎng)細胞；溫度過高或時間過長可能損傷甚至殺死目標芽孢。水浴鍋溫度需校準。
D-環(huán)絲氨酸：必須過濾除菌，并在傾注培養(yǎng)基前臨用加入。其濃度對選擇性至關重要。
厭氧培養(yǎng)：確保厭氧裝置密封良好且產(chǎn)氣正常，創(chuàng)造有效的厭氧環(huán)境是目標菌落產(chǎn)生黑色沉淀的必要條件。
培養(yǎng)基溫度：傾注時培養(yǎng)基溫度不能過高（>50°C可能燙傷芽孢），也不能過低（<45°C可能提前凝固，混合不均）。
菌落識別：準確識別典型黑色帶暈環(huán)的菌落是正確計數(shù)的關鍵。需由有經(jīng)驗的人員進行操作或進行菌落確證。
無菌操作：整個實驗過程必須嚴格遵守無菌操作規(guī)程，防止污染。
平行試驗：通常每個稀釋度做兩個或三個平行平板，以提高結果的準確性和可靠性。
培養(yǎng)基質(zhì)量控制：使用前應進行培養(yǎng)基的質(zhì)量控制，確保其支持目標菌生長并抑制雜菌。
通過嚴格遵循TSC培養(yǎng)基的原理和標準化的使用方法，可以相對準確地定量檢測樣品（特別是食品、益生菌制品等）中凝結芽孢桿菌的數(shù)量。
北京百歐博偉生物技術有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務！也正因為此，北京百歐博偉生物技術有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關系！
下載附件
上一篇：甘露醇氯化鈉瓊脂糖培養(yǎng)基的核心成分和作用機制及應用！
下一篇：梭菌增菌培養(yǎng)基的原理與使用方法及應用場景與常見問題！