微生物凍干粉菌種的復(fù)蘇與接種及培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程！
小楊 / 2025-07-10 08:51:12
一、菌種復(fù)蘇
1、實(shí)驗準(zhǔn)備
無菌操作臺（提前30分鐘開啟紫外滅菌）
配套液體培養(yǎng)基（按菌種特性選擇）
無菌移液器具（1mL移液槍及無菌槍頭）
接種環(huán)（酒精燈滅菌備用）
適宜固體培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂平板/斜面）
恒溫培養(yǎng)箱（提前校準(zhǔn)溫度）
2、操作流程
(1)表面消毒
使用75%酒精棉球?qū)龈煞郯碴称窟M(jìn)行三次 擦拭消毒（每次旋轉(zhuǎn)90°）
(2)開啟容器
①在生物安全柜內(nèi)操作
②沿鋁蓋壓痕方向撕開外層密封
③無菌鑷子取下橡膠塞
(3)水化復(fù)蘇
①預(yù)溫配套培養(yǎng)基至30±2℃
②緩慢加入0.5-1mL培養(yǎng)基（沿管壁）
③靜置5分鐘使凍干粉充分溶解
④輕柔渦旋混勻（避免產(chǎn)生氣泡）
(4)初級培養(yǎng)
①取100μL菌懸液劃線接種于平板
②剩余懸液轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基
③明確標(biāo)注：菌株編號+代次+日期+操作者
(5)培養(yǎng)觀察
①平板倒置培養(yǎng)
②設(shè)置雙溫度培養(yǎng)（最適溫度±5℃）
③每8小時觀察生長狀況
二、接種與傳代
1、接種方法
(1)平板四區(qū)劃線法
①接種環(huán)滅菌冷卻后取單菌落
②依次完成4個區(qū)域的密集-稀疏劃線
③每區(qū)旋轉(zhuǎn)平板60°
(2)液體接種
①選擇對數(shù)生長期菌液
②按1-2%接種量轉(zhuǎn)接
③添加玻璃珠提高分散度
2、培養(yǎng)條件優(yōu)化
(1)需氧菌：保持5% CO?環(huán)境
(2)厭氧菌：使用厭氧培養(yǎng)罐
(3)溫度梯度：設(shè)置3個溫差±2℃的平行樣
三、質(zhì)量控制
1、純度驗證
(1)革蘭染色鏡檢
(2)不同溫度下培養(yǎng)特性驗證
(3)生化反應(yīng)鑒定
2、污染防控
(1)每批次做空白培養(yǎng)基對照
(2)關(guān)鍵步驟設(shè)置陽性對照
(3)使用選擇性抑制劑培養(yǎng)基
四、注意事項
1、生物安全
(1)二級生物安全防護(hù)
(2)廢棄物121℃高壓滅菌30分鐘
2、保存規(guī)范
(1)工作菌株不超過5代
(2)原始菌株-80℃超低溫保存
(3)建立菌種使用臺賬
3、異常處理
(1)復(fù)蘇失敗時采用梯度復(fù)活法
(2)污染菌株立即滅菌處理
(3)變異菌株重新分離純化
本規(guī)程需配合菌種說明書使用，操作人員應(yīng)接受專業(yè)培訓(xùn)并保留完整實(shí)驗記錄。關(guān)鍵步驟建議雙人復(fù)核。
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