乳酸菌檢驗計數(shù)方法的分類與操作流程及結(jié)果判讀規(guī)則！
小楊 / 2025-07-24 10:22:56
百歐博偉生物：乳酸菌檢驗的計數(shù)是評估發(fā)酵食品（如酸奶、泡菜）、益生菌制劑等樣品中乳酸菌活菌數(shù)量的核心步驟，需嚴(yán)格遵循操作規(guī)范以保證結(jié)果準(zhǔn)確性。以下從計數(shù)方法分類、操作流程、結(jié)果判讀規(guī)則及注意事項進(jìn)行詳解。
一、計數(shù)方法分類及適用場景
乳酸菌計數(shù)的核心是活菌培養(yǎng)計數(shù)法（基于“一個活菌形成一個菌落”的原理），根據(jù)樣品中菌含量高低，分為以下兩種常用方法：
1、平板涂布法（適用于菌含量中等的樣品）
原理：將稀釋后的樣品均勻涂布在固體培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)后計數(shù)菌落，推算原始樣品中的活菌數(shù)。
優(yōu)勢：操作簡單，菌落分布均勻，計數(shù)誤差??；
適用場景：酸奶、發(fā)酵乳等菌含量在 10?-10? CFU/g（mL）的樣品。
2、傾注平板法（適用于菌含量較低的樣品）
原理：將稀釋后的樣品與冷卻至 45-50℃的液態(tài)培養(yǎng)基混合，倒入平板，凝固后培養(yǎng)，菌落均勻生長在培養(yǎng)基內(nèi)部或表面。
優(yōu)勢：能捕獲更多活菌（尤其對部分厭氧性較強(qiáng)的乳酸菌），適用于低菌含量樣品；
不足：菌落可能重疊（內(nèi)部菌落不易觀察），計數(shù)時需注意區(qū)分；
適用場景：益生菌片劑（需研磨溶解）、發(fā)酵初期樣品等菌含量＜10? CFU/g（mL）的樣品。
二、核心操作流程（以平板涂布法為例）
1、樣品稀釋（關(guān)鍵步驟：避免稀釋誤差）
稀釋液選擇：使用0.85% 無菌生理鹽水或磷酸緩沖鹽溶液（PBS），避免滲透壓對乳酸菌的損傷（乳酸菌為革蘭氏陽性菌，對滲透壓敏感）。
稀釋梯度設(shè)計：
根據(jù)樣品預(yù)期菌含量確定稀釋倍數(shù)：例如酸奶中乳酸菌含量通常為 10?-10? CFU/mL，需稀釋至 10??、10??、10??梯度；
操作要求：
按“1mL 樣品 + 9mL 稀釋液”進(jìn)行10 倍系列稀釋（如 10?¹→10?²→…→10??），每梯度更換無菌移液槍頭；
稀釋時需充分振蕩（用渦旋混合器或手搓試管 10-15 秒），確保菌液均勻分散，避免成團(tuán)乳酸菌未散開導(dǎo)致計數(shù)偏低。
2、培養(yǎng)基選擇（需滿足乳酸菌生長特性）
核心要求：乳酸菌為兼性厭氧或微需氧菌，且多數(shù)為革蘭氏陽性、不產(chǎn)芽孢，需選擇選擇性培養(yǎng)基抑制雜菌（如
大腸菌群、
酵母菌）。
常用培養(yǎng)基：
MRS 培養(yǎng)基：最常用，營養(yǎng)豐富（含酵母浸粉、葡萄糖、吐溫 - 80），能促進(jìn)絕大多數(shù)乳酸菌（乳桿菌、鏈球菌等）生長；
改良 MC 培養(yǎng)基（適用于雙歧桿菌計數(shù)，需添加半胱氨酸作為還原劑）。
3、接種與培養(yǎng)（控制厭氧環(huán)境）
接種量：選擇2-3 個連續(xù)稀釋梯度（確保每個平板菌落數(shù)在 30-300 CFU 之間，此范圍為計數(shù)有效區(qū)間），每個梯度做2-3 個平行平板，每平板接種 0.1mL 稀釋液（涂布法）或 1mL（傾注法）。
涂布操作：用無菌 L 型玻璃棒（提前在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后使用）將 0.1mL 樣品均勻涂布在培養(yǎng)基表面，待液體吸收后倒置培養(yǎng)。
培養(yǎng)條件：
溫度：36±1℃（乳酸菌最適生長溫度）；
厭氧環(huán)境：用厭氧培養(yǎng)盒（放入?yún)捬醮?，產(chǎn)生 H?和 CO?，去除 O?）或厭氧培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間 48±2 小時（確保菌落充分生長）。
4、菌落計數(shù)與結(jié)果計算
菌落形態(tài)識別：乳酸菌在 MRS 培養(yǎng)基上的典型菌落為圓形、邊緣整齊、表面光滑、乳白色或淺灰白色，直徑 0.5-2mm（不同菌株略有差異）；需排除雜菌（如酵母菌菌落較大、邊緣不整，霉菌有菌絲）。
計數(shù)規(guī)則：
選擇菌落數(shù)在30-300 CFU的平板計數(shù)（低于 30 為“太少，誤差大”，高于 300 為“太多，菌落重疊”）；
若同一稀釋梯度的平行平板菌落數(shù)差值≤1 倍（如 100 和 150 CFU），取平均值；若差值＞1 倍，需重新實驗；
若所有平板菌落數(shù)均＜30 CFU，以最低稀釋度的平均菌落數(shù)計算（需注明 “＜XX CFU/g”）；若均＞300 CFU，以最高稀釋度計算。
結(jié)果計算公式：
活菌數(shù)（CFU/g 或 mL）= 平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 1 / 接種量（涂布法接種 0.1mL 時，×10；傾注法接種 1mL 時，×1）
例：10??稀釋度的平板平均菌落數(shù)為 150 CFU，接種 0.1mL，則：
活菌數(shù) = 150 × 10? × 10 = 1.5×10¹? CFU/mL。
三、關(guān)鍵規(guī)則與結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)
1、有效計數(shù)區(qū)間：
僅統(tǒng)計菌落數(shù)在 30-300 CFU 的平板，若同一稀釋梯度的平板中部分在區(qū)間內(nèi)、部分超出，僅用區(qū)間內(nèi)平板計算（如 10??梯度 2 個平板分別為 280 和 320 CFU，取 280 計算）。
2、稀釋梯度選擇：
需覆蓋“菌落數(shù)從少到多”的連續(xù)梯度，例如樣品預(yù)期菌含量高時，需稀釋至 10??甚至 10??，避免所有平板菌落數(shù)均＞300。
3、雜菌排除規(guī)則：
若雜菌數(shù)≤10%（相對于乳酸菌菌落數(shù)），可忽略；
若雜菌數(shù)＞10%，需重新檢測（可能是樣品污染或培養(yǎng)基失效）；
疑難菌落需通過革蘭氏染色（乳酸菌為革蘭氏陽性、無芽孢）或生化試驗（如發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸）確認(rèn)。
4、結(jié)果報告要求：
以“CFU/g”或“CFU/mL”為單位，保留兩位有效數(shù)字（如 2.5×10? CFU/g）；
若菌落數(shù)＜30 CFU / 平板，報告為“＜XX CFU/g”（如＜3.0×10? CFU/g）；
注明檢測方法（如“MRS 培養(yǎng)基，平板涂布法”）和培養(yǎng)條件。
四、注意事項（減少誤差與污染）
1、無菌操作：
稀釋液、培養(yǎng)基需高壓滅菌（121℃，15 分鐘）；
操作在超凈工作臺進(jìn)行，避免環(huán)境雜菌污染（如手接觸樣品、平板開蓋時間過長）。
2、稀釋準(zhǔn)確性：
移液槍需定期校準(zhǔn)，確保移液體積準(zhǔn)確；
稀釋時每梯度充分振蕩（尤其樣品含顆粒時，如泡菜需均質(zhì)后稀釋）。
3、厭氧環(huán)境控制：
厭氧袋需在有效期內(nèi)使用（包裝破損或過期會導(dǎo)致厭氧失?。?；
培養(yǎng)前檢查厭氧盒密封性，避免 O?進(jìn)入抑制乳酸菌生長。
4、菌落識別訓(xùn)練：
新手需通過已知標(biāo)準(zhǔn)菌株（如
保加利亞乳桿菌）的菌落形態(tài)對比，避免誤將雜菌計入。
五、總結(jié)
乳酸菌計數(shù)的核心是“稀釋準(zhǔn)確→培養(yǎng)規(guī)范→計數(shù)有效”：通過梯度稀釋控制菌落數(shù)在 30-300 CFU 區(qū)間，用 MRS 培養(yǎng)基和厭氧條件選擇性培養(yǎng)，結(jié)合菌落形態(tài)排除雜菌，最終以平行平板的平均值計算活菌數(shù)。嚴(yán)格遵循操作規(guī)則可減少誤差，確保結(jié)果能真實反映樣品中乳酸菌的活性（活菌數(shù)是評估發(fā)酵食品品質(zhì)和益生菌有效性的關(guān)鍵指標(biāo)）。
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