檢測(cè)和鑒定細(xì)胞培養(yǎng)中真菌污染的具體操作步驟與方法！
小楊 / 2025-08-04 10:04:29
百歐博偉生物：檢測(cè)和鑒定細(xì)胞培養(yǎng)中的真菌污染，需結(jié)合形態(tài)觀察、理化指標(biāo)監(jiān)測(cè)、特異性檢測(cè)等方法，從“是否污染”到“污染真菌種類”逐步確認(rèn)。不同階段的檢測(cè)目標(biāo)不同：早期需快速判斷“是否污染”，后續(xù)需精準(zhǔn)鑒定“真菌類型”（為追溯污染源或選擇處理方式提供依據(jù)）。以下是具體步驟和方法：
一、初步檢測(cè)：快速判斷是否存在真菌污染（適合日常篩查）
真菌污染在早期可能無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)變化，但通過(guò)形態(tài)觀察和培養(yǎng)基指標(biāo)監(jiān)測(cè)可快速識(shí)別，尤其適合每日細(xì)胞巡檢。
1、肉眼觀察：識(shí)別典型污染特征
真菌污染的肉眼表現(xiàn)隨種類和污染程度變化，可作為初步判斷依據(jù)：
絲狀真菌（如
曲霉、
毛霉）：污染 12-24 小時(shí)后，培養(yǎng)基表面或邊緣會(huì)出現(xiàn)白色 / 綠色 / 黑色絮狀菌落（菌絲聚集形成），懸浮培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基會(huì)逐漸渾濁（呈棉絮狀）；
酵母菌（如
白念珠菌）：早期無(wú)明顯絮狀物，僅表現(xiàn)為培養(yǎng)基輕微渾濁（類似細(xì)菌污染，但渾濁度更低），后期可能形成白色顆粒狀沉淀（酵母細(xì)胞聚集）；
培養(yǎng)基顏色變化：多數(shù)真菌代謝會(huì)產(chǎn)酸，導(dǎo)致含酚紅指示劑的培養(yǎng)基從紅色（pH7.2）逐漸變黃（pH<6.8），但速度慢于細(xì)菌污染（細(xì)菌污染可能 2-4 小時(shí)變黃）。
2、顯微鏡觀察：確診污染并區(qū)分真菌與其他污染源
肉眼疑似污染后，必須通過(guò)顯微鏡觀察（40-100 倍物鏡）確認(rèn)，這是區(qū)分“真菌污染”“細(xì)菌污染”“細(xì)胞碎片”的關(guān)鍵：
絲狀真菌：可見(jiàn)分支狀菌絲（直徑 2-10μm），部分菌絲有隔（如
曲霉），部分無(wú)隔（如
毛霉），菌絲可能纏繞細(xì)胞或漂浮在培養(yǎng)基中；
酵母菌：呈圓形 / 橢圓形單細(xì)胞（直徑 5-10μm），比細(xì)菌大（細(xì)菌通常 1-2μm），可觀察到出芽生殖（特征性“母子細(xì)胞相連”形態(tài)）；
3、與其他污染的區(qū)分：
細(xì)菌污染：顯微鏡下為大量細(xì)小點(diǎn)狀顆粒（無(wú)菌絲），培養(yǎng)基渾濁更快（2-6 小時(shí)）；
細(xì)胞碎片：形態(tài)不規(guī)則、無(wú)運(yùn)動(dòng)性，且不會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間增多。
操作技巧：觀察時(shí)選擇細(xì)胞密度較低的區(qū)域，避免細(xì)胞本身遮擋；若懷疑酵母菌污染，可滴加少量 0.1% 亞甲藍(lán)染色（活菌不著色，死菌和真菌著色，更易區(qū)分）。
二、進(jìn)階鑒定：明確污染真菌的種類（適合追溯污染源或研究需求）
若需確定“污染真菌的具體種類”（如判斷是來(lái)自培養(yǎng)箱、操作人員還是試劑），需通過(guò)培養(yǎng)分離和特異性鑒定方法，精度從“大類”到“菌株”逐步提升。
1、真菌分離培養(yǎng)：獲得純培養(yǎng)物
從污染的細(xì)胞培養(yǎng)體系中分離真菌，避免細(xì)胞和培養(yǎng)基成分干擾后續(xù)鑒定：
步驟：
取 100μL 污染的培養(yǎng)基，接種至真菌專用培養(yǎng)基（如 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂，適合多數(shù)真菌生長(zhǎng)；Sabouraud 培養(yǎng)基：含葡萄糖和蛋白胨，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)）；
28℃培養(yǎng)（真菌最適溫度低于哺乳動(dòng)物細(xì)胞），絲狀真菌 1-3 天可見(jiàn)菌落，酵母菌 2-5 天可見(jiàn)菌落；
挑取單菌落（避免雜菌），轉(zhuǎn)接至新培養(yǎng)基純化（連續(xù)傳代 2-3 次），獲得純培養(yǎng)的真菌。
2、形態(tài)學(xué)鑒定：基于菌落和顯微特征（傳統(tǒng)方法）
通過(guò)菌落形態(tài)（顏色、質(zhì)地）和菌絲 / 孢子特征，可初步歸類真菌種類，適合實(shí)驗(yàn)室快速鑒定：
真菌類型 菌落特征（PDA 培養(yǎng)基） 顯微特征（染色后觀察）
曲霉 圓形，表面有放射狀紋理，顏色多樣，背面黃色 菌絲有隔，分生孢子梗頂端呈“燒瓶狀”，表面有鏈狀孢子
毛霉 白色棉絮狀，快速蔓延（1-2 天覆蓋培養(yǎng)基），背面無(wú)色 菌絲無(wú)隔，孢子囊呈“球形”，生于直立菌絲頂端
酵母菌 圓形，光滑濕潤(rùn)，乳白色，邊緣整齊 單細(xì)胞，圓形 / 橢圓形，可見(jiàn)出芽；部分有假菌絲
青霉 灰綠色，菌落邊緣白色，質(zhì)地絨狀 菌絲有隔，分生孢子梗呈“帚狀分支”，孢子鏈狀排列
染色輔助：可用乳酸酚棉藍(lán)染色（真菌細(xì)胞壁著色，背景透明），清晰觀察菌絲和孢子結(jié)構(gòu)。
3、分子生物學(xué)鑒定：精準(zhǔn)到種（金標(biāo)準(zhǔn)）
若需明確具體“種”（如區(qū)分
白念珠菌和
熱帶念珠菌），或形態(tài)學(xué)難以判斷時(shí)，通過(guò)基因測(cè)序鑒定：
目標(biāo)基因：真菌的ITS 序列（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，位于 18S 和 28S rRNA 基因之間，種間差異大，保守性高）；
步驟：
從純培養(yǎng)的真菌中提取基因組 DNA（用真菌 DNA 提取試劑盒，去除細(xì)胞壁）；
用 ITS 通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；
對(duì) PCR 產(chǎn)物測(cè)序，將序列上傳至數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，匹配度≥97% 可確定種類。
4、其他輔助方法（根據(jù)需求選擇）
生化鑒定：針對(duì)酵母菌，通過(guò)檢測(cè)代謝能力（如碳源利用、酶活性）鑒定；
質(zhì)譜鑒定：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，通過(guò)檢測(cè)真菌的特征蛋白譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)（類似細(xì)菌鑒定），快速且精準(zhǔn)，但依賴設(shè)備。
三、注意事項(xiàng)：避免檢測(cè)過(guò)程中的二次污染或誤判
區(qū)分“污染真菌”與“環(huán)境雜菌”：
檢測(cè)時(shí)需同步做陰性對(duì)照（如未接種的 PDA 培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)），若對(duì)照也長(zhǎng)出真菌，說(shuō)明操作過(guò)程中引入環(huán)境雜菌（如空氣、操作臺(tái)污染），需重新分離；
細(xì)胞碎片的誤判排除：
若顯微鏡下觀察到“顆粒狀物質(zhì)”，可通過(guò)“運(yùn)動(dòng)性”判斷：真菌（尤其酵母菌）可能有輕微布朗運(yùn)動(dòng)，而細(xì)胞碎片完全靜止；也可通過(guò)染色（如臺(tái)盼藍(lán)），真菌細(xì)胞完整（不著色或淺著色），碎片無(wú)完整結(jié)構(gòu)（深著色）；
早期微量污染的檢測(cè)：
若懷疑“隱性污染”（細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但無(wú)明顯渾濁），可通過(guò)真菌特異性 PCR（直接以污染的細(xì)胞培養(yǎng)基為模板，擴(kuò)增 ITS 序列），比培養(yǎng)法更靈敏（可檢測(cè)到 10 個(gè)以下孢子）。
總結(jié)：檢測(cè)與鑒定流程
初步篩查：每日觀察細(xì)胞培養(yǎng)體系（肉眼看培養(yǎng)基渾濁度、顏色；顯微鏡看是否有菌絲 / 孢子）→ 確定是否污染；
分離純化：若污染，接種至真菌培養(yǎng)基，獲得純培養(yǎng)物；
種類鑒定：
快速判斷：形態(tài)學(xué)（菌落 + 顯微特征）；
精準(zhǔn)鑒定：分子測(cè)序（ITS 序列）或質(zhì)譜；
結(jié)果應(yīng)用：根據(jù)真菌種類追溯污染源（如曲霉多來(lái)自空氣，酵母菌可能來(lái)自操作人員手部），并優(yōu)化后續(xù)無(wú)菌操作。
通過(guò)以上步驟，可從“是否污染”到“污染何種真菌”形成完整判斷，為后續(xù)處理（如丟棄污染樣本、消毒培養(yǎng)環(huán)境）提供依據(jù)，避免污染擴(kuò)散或?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)失真。
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