小鼠結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中防止污染的操作規(guī)程！
小楊 / 2025-08-09 09:20:44
小鼠結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)中，污染是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因之一（尤其是原代培養(yǎng)，組織來源復(fù)雜且操作步驟多）。需從取材、試劑、操作、環(huán)境等全流程采取嚴(yán)格防控措施，具體如下：
一、取材階段：源頭控制污染
1、動(dòng)物預(yù)處理
選擇無特定病原體（SPF 級）小鼠，避免攜帶隱性感染（如腸道細(xì)菌、病毒）。處死前可通過飲水或腹腔注射抗生素（如青霉素）預(yù)處理 1-2 天，降低腸道內(nèi)源性細(xì)菌負(fù)荷。
無菌取材操作：
小鼠處死后，用 75% 酒精全身擦拭消毒，在超凈工作臺內(nèi)解剖，避免接觸非無菌區(qū)域（如皮毛、工作臺邊緣）。
取出結(jié)腸后，立即放入預(yù)冷的含高濃度雙抗的 PBS（青霉素 + 鏈霉素終濃度各 200 U/mL，常規(guī)濃度的 2-4 倍）中，反復(fù)沖洗腸腔至無糞便殘留（糞便含大量細(xì)菌，是污染主要源頭）。
剝離粘膜層時(shí)，若發(fā)現(xiàn)腸壁充血、化膿等異常，直接丟棄該組織，避免污染擴(kuò)散。
2、組織處理的無菌性
所有接觸組織的器械（剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿）需經(jīng)高壓滅菌或一次性無菌耗材，使用前用 75% 酒精擦拭并在酒精燈火焰旁冷卻（避免高溫?fù)p傷組織）。
粘膜組織剪碎后，可先用含抗生素的 PBS 浸泡 10 分鐘，進(jìn)一步減少表面污染。
二、試劑與耗材：確保無菌且無毒性
1、試劑制備與儲存
所有試劑（培養(yǎng)基、酶、PBS、血清等）需嚴(yán)格無菌處理：
培養(yǎng)基、PBS 等通過 0.22 μm 濾膜過濾除菌（避免高壓滅菌破壞成分）；酶類（如胰蛋白酶、膠原酶）可分裝后 - 20℃凍存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致活性下降和污染風(fēng)險(xiǎn)增加。
胎牛血清（FBS）需篩選批次，優(yōu)先選擇經(jīng)無菌檢測（如
支原體、
細(xì)菌）的產(chǎn)品，必要時(shí)可 56℃滅活 30 分鐘（破壞補(bǔ)體，減少潛在污染，但可能降低生長因子活性，需權(quán)衡）。
試劑儲存：避免在室溫下久放，開封后的培養(yǎng)基 4℃保存不超過 2 周，添加生長因子的完全培養(yǎng)基建議 2-3 天內(nèi)用完。
2、耗材選擇與處理
選用無菌包裝的一次性耗材（培養(yǎng)皿、離心管、移液槍頭），開封前檢查包裝完整性，避免使用破損包裝的耗材。
重復(fù)使用的器械（如剪刀、鑷子）需徹底清洗后，高壓蒸汽滅菌（121℃，30 分鐘），冷卻后在超凈臺內(nèi)開封使用。
三、操作過程：嚴(yán)格無菌操作規(guī)范
1、超凈工作臺管理
操作前 30 分鐘開啟超凈臺紫外燈消毒，關(guān)閉后通風(fēng) 10 分鐘（避免紫外殘留損傷細(xì)胞）；用 75% 酒精擦拭工作臺面、移液器及手臂（戴無菌手套后）。
操作時(shí)，試劑瓶、培養(yǎng)皿等開口需朝向酒精燈火焰旁（形成無菌區(qū)），避免瓶口接觸非無菌表面；移液時(shí)避免產(chǎn)生氣泡（氣泡破裂可能帶入污染物）。
2、消化與離心環(huán)節(jié)
酶解體系需在無菌條件下配制，消化過程中每隔 5-10 分鐘觀察細(xì)胞狀態(tài)，避免長時(shí)間暴露在超凈臺外。
離心時(shí)，離心管蓋需擰緊，離心結(jié)束后用 75% 酒精擦拭管外壁再放入超凈臺，打開蓋子時(shí)避免手指接觸管口。
3、避免交叉污染
不同樣本（如正常與病變組織細(xì)胞）需分開操作，更換樣本時(shí)徹底消毒工作臺和移液器，更換手套。
廢棄液體（如消化廢液）需倒入含消毒液（如 84 消毒液）的專用容器，廢棄耗材（如污染的培養(yǎng)皿）需密封后按醫(yī)療廢物處理。
四、培養(yǎng)環(huán)境：定期監(jiān)測與維護(hù)
1、培養(yǎng)箱管理
每周用 75% 酒精擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁、隔板，定期更換培養(yǎng)箱內(nèi)的水盤（使用無菌水，避免霉菌滋生）。
監(jiān)測 CO?濃度和溫度：每日觀察培養(yǎng)箱參數(shù)，若發(fā)現(xiàn)異常（如溫度波動(dòng)、CO?泄漏），立即轉(zhuǎn)移細(xì)胞至備用培養(yǎng)箱，排查故障。
2、細(xì)胞狀態(tài)監(jiān)測
每日鏡檢細(xì)胞：若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁（細(xì)菌污染呈云霧狀、pH 驟降變黃）、出現(xiàn)白色 / 黑色絮狀物（真菌污染）或顆粒沉淀，立即判斷污染類型并處理：
輕度污染（早期）：可嘗試用高濃度雙抗（如青霉素 + 鏈霉素各 500 U/mL）處理，但原代細(xì)胞對藥物敏感，效果有限，建議優(yōu)先丟棄。
嚴(yán)重污染：立即將污染培養(yǎng)皿密封，移出培養(yǎng)箱，避免污染擴(kuò)散；徹底消毒培養(yǎng)箱及周邊環(huán)境。
五、應(yīng)急處理：污染擴(kuò)散的防控
若發(fā)生大規(guī)模污染（如多個(gè)樣本同時(shí)污染），需停止所有操作，排查污染源（如試劑、耗材、培養(yǎng)箱），對所有可能污染的物品徹底消毒或更換。
操作人員若接觸污染樣本，需立即用 75% 酒精消毒接觸部位，避免實(shí)驗(yàn)室人員感染（尤其注意人畜共患病原菌）。
六、總結(jié)
防止污染的核心是“全程無菌 + 源頭控制”：從動(dòng)物取材的嚴(yán)格消毒，到試劑耗材的無菌驗(yàn)證，再到操作過程的規(guī)范細(xì)致，每一步都需謹(jǐn)慎。原代結(jié)腸上皮細(xì)胞本身脆弱，一旦污染很難挽救，因此“預(yù)防”比“處理”更重要，需建立標(biāo)準(zhǔn)化操作流程并嚴(yán)格執(zhí)行。
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