臨床微生物檢驗中最常見的細菌類別之一：革蘭陽性球菌
小楊 / 2025-10-15 09:38:33
革蘭陽性球菌是臨床微生物檢驗中最常見的細菌類別之一，其鑒定需結(jié)合形態(tài)學特征、培養(yǎng)特性、生化反應、血清學試驗及分子生物學檢測等多維度證據(jù)，核心目標是明確菌種，為抗感染治療和流行病學分析提供依據(jù)。以下是革蘭陽性球菌的系統(tǒng)鑒定流程與關(guān)鍵技術(shù)。
一、鑒定前的核心初篩：形態(tài)與染色特征
革蘭染色是鑒定的第一步，通過顯微鏡觀察細菌的染色性、形態(tài)、排列方式，可快速將革蘭陽性球菌與其他細菌（如革蘭陰性菌、革蘭陽性桿菌）區(qū)分，并初步歸類至不同屬。
常見革蘭陽性球菌的形態(tài)與排列特征對比：
細菌屬 革蘭染色結(jié)果 形態(tài) 典型排列方式 關(guān)鍵鑒別點
葡萄球菌屬（Staphylococcus） 紫色（陽性） 球形，直徑 0.5-1.5μm 不規(guī)則簇狀 無鞭毛、無芽孢，部分菌株有莢膜
鏈球菌屬（Streptococcus） 紫色（陽性） 球形/橢圓形，直徑 0.5-1.0μm 鏈狀（長短不一，短鏈如雙球菌） 無鞭毛、無芽孢，多數(shù)無莢膜
腸球菌屬（Enterococcus） 紫色（陽性） 球形/橢圓形，直徑 0.5-1.0μm 短鏈或成雙排列 形態(tài)與鏈球菌相似，需通過生化區(qū)分
微球菌屬（Micrococcus） 紫色（陽性） 球形，直徑 0.5-2.0μm 四聯(lián)狀或不規(guī)則簇狀 比葡萄球菌略大，氧化酶陽性（葡萄球菌陰性）
二、培養(yǎng)特性：基于培養(yǎng)基的初步分離與鑒別
不同
革蘭陽性球菌對營養(yǎng)的需求、氧氣耐受性及菌落形態(tài)差異顯著，通過選擇性培養(yǎng)基（抑制雜菌）和鑒別培養(yǎng)基（區(qū)分菌種）的培養(yǎng)結(jié)果，可進一步縮小鑒定范圍。
1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（NA）與血瓊脂（BA）
營養(yǎng)瓊脂：多數(shù)革蘭陽性球菌可生長，形成圓形、光滑的菌落（如葡萄球菌菌落直徑 2-3mm，微球菌 1-2mm）。
血瓊脂（含 5%-10% 羊血）：核心鑒別培養(yǎng)基，通過溶血現(xiàn)象區(qū)分鏈球菌/腸球菌，同時觀察菌落形態(tài)：
α- 溶血（草綠色溶血）：菌落周圍出現(xiàn)草綠色溶血環(huán)（紅細胞部分溶解），常見于
肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌。
β- 溶血（完全溶血）：菌落周圍出現(xiàn)透明溶血環(huán)（紅細胞完全溶解），常見于金黃色葡萄球菌、A 群鏈球菌（
化膿鏈球菌）、B 群鏈球菌（
無乳鏈球菌）。
γ- 溶血（不溶血）：菌落周圍無溶血環(huán)，常見于腸球菌、D 群鏈球菌。
2、選擇性培養(yǎng)基
甘露醇鹽瓊脂（MSA）：高鹽（7.5% NaCl）環(huán)境抑制非葡萄球菌生長，同時通過“甘露醇發(fā)酵”鑒別葡萄球菌：
金黃色葡萄球菌：發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基（含酚紅指示劑）由紅變黃，菌落黃色。
膽汁七葉苷瓊脂（BEA）：用于鑒別腸球菌（及 D 群鏈球菌）：腸球菌可在膽汁中生長，并水解七葉苷生成黑色物質(zhì)，培養(yǎng)基變黑；其他鏈球菌不生長或不顯色。
三、生化反應：菌種鑒定的核心依據(jù)
通過檢測細菌對碳水化合物的發(fā)酵能力、酶的產(chǎn)生等生化特性，可精準區(qū)分不同屬、種的革蘭陽性球菌。以下是關(guān)鍵生化試驗的應用：
1、觸酶試驗（Catalase Test）：區(qū)分葡萄球菌屬與鏈球菌/腸球菌屬
原理：觸酶（過氧化氫酶）可分解 H?O?生成 O?和 H?O，產(chǎn)生氣泡。
結(jié)果判斷：
陽性（有氣泡）：葡萄球菌屬、微球菌屬（排除鏈球菌/腸球菌）。
陰性（無氣泡）：鏈球菌屬、腸球菌屬。
2、氧化酶試驗（Oxidase Test）：區(qū)分葡萄球菌屬與微球菌屬
原理：氧化酶可將二甲基對苯二胺氧化為紫色物質(zhì)。
結(jié)果判斷：
陽性：微球菌屬（如藤黃微球菌）。
陰性：葡萄球菌屬（核心鑒別點）。
3、凝固酶試驗：區(qū)分致病性葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）與凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）
原理：凝固酶可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，導致血漿凝固，是金黃色葡萄球菌的重要毒力因子。
試驗類型：
玻片法（檢測結(jié)合型凝固酶）：快速篩查，陽性者血漿滴加細菌后立即出現(xiàn)凝塊。
試管法（檢測游離型凝固酶）：確診試驗，陽性者血漿在 37℃孵育 1-4h 后凝固。
結(jié)果意義：
4、鏈球菌的生化分群：基于“Lancefield 群特異性抗原”與生化試驗
鏈球菌屬按 Lancefield 抗原可分為 A、B、C、D、F、G 等群，臨床常用血清學試驗（乳膠凝集法）檢測群抗原，結(jié)合生化試驗確認：
A 群鏈球菌（化膿鏈球菌）：桿菌肽敏感試驗陽性、PYR 試驗陽性。
B 群鏈球菌（無乳鏈球菌）：CAMP 試驗（協(xié)同溶血試驗）陽性、馬尿酸鈉水解試驗陽性。
D 群鏈球菌/腸球菌：BEA 試驗陽性，腸球菌還可在 6.5% NaCl 培養(yǎng)基中生長（鏈球菌多數(shù)不生長）、45℃下可生長（鏈球菌多不生長）。
5、肺炎鏈球菌的鑒別：形態(tài) + 生化 + Optochin 試驗
肺炎鏈球菌是 α- 溶血鏈球菌中最常見的致病菌（致肺炎、腦膜炎），需與草綠色鏈球菌區(qū)分：
形態(tài)：典型“矛頭狀”雙球菌，有莢膜（墨汁染色可見莢膜光環(huán)）。
Optochin 試驗（乙基氫化羥基奎寧敏感試驗）：肺炎鏈球菌對 Optochin 敏感，菌落周圍出現(xiàn)抑菌環(huán)（直徑≥14mm）；草綠色鏈球菌耐藥，無抑菌環(huán)。
膽汁溶菌試驗：肺炎鏈球菌可被膽汁（或去氧膽酸鈉）溶解，菌落消失；草綠色鏈球菌不溶解。
四、血清學試驗：快速確認特定菌種/血清型
血清學試驗基于“抗原 - 抗體特異性結(jié)合”原理，適用于已初步歸類的細菌，快速確認菌種或血清型，尤其適用于臨床急需結(jié)果的場景。
應用場景 1：鏈球菌分群：使用 Lancefield 群特異性抗血清，通過乳膠凝集法檢測細菌表面抗原，10-15 分鐘可出結(jié)果。
應用場景 2：葡萄球菌鑒定：針對金黃色葡萄球菌的特異性抗原的抗體，可快速確認菌種。
應用場景 3：肺炎鏈球菌血清型：使用特異性抗血清檢測莢膜抗原，明確血清型。
五、分子生物學檢測：精準鑒定與耐藥基因分析
傳統(tǒng)生化鑒定存在“耗時久（1-2 天）、難區(qū)分近緣種（如葡萄球菌屬內(nèi)近緣種）”的局限，分子生物學技術(shù)可直接檢測細菌的核酸（DNA/RNA），實現(xiàn)快速、精準鑒定，同時可檢測耐藥基因。
1、常用技術(shù)
PCR 技術(shù)：通過特異性引物擴增目標基因（如葡萄球菌的nuc基因、鏈球菌的16S rRNA基因），擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳或測序確認菌種。
16S rRNA 基因測序：16S rRNA 基因是細菌的“管家基因”，序列保守且種間差異顯著，通過測序與數(shù)據(jù)庫比對，可精準鑒定到“種”甚至“亞種”（適用于難培養(yǎng)或生化不典型菌株）。
實時熒光定量 PCR（qPCR）：不僅可鑒定菌種，還可定量檢測細菌載量，同時檢測耐藥基因（如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 MRSA 的mecA基因、腸球菌的vanA/vanB基因，預測萬古霉素耐藥性）。
2、優(yōu)勢與應用場景
優(yōu)勢：快速（數(shù)小時出結(jié)果）、靈敏度高（可檢測低濃度菌液或污染樣本）、特異性強（避免生化反應假陽性/假陰性）。
適用場景：重癥感染、疑難菌株鑒定（生化不典型）、耐藥菌篩查。
六、鑒定流程總結(jié)（臨床實驗室標準路徑）
標本處理：取臨床標本涂片，進行革蘭染色，顯微鏡觀察形態(tài)與排列（初篩屬別）。
分離培養(yǎng)：接種血瓊脂、選擇性培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 18-24h，觀察菌落形態(tài)與溶血現(xiàn)象。
初篩試驗：對菌落進行觸酶試驗（區(qū)分葡萄球菌與鏈球菌/腸球菌）、氧化酶試驗（區(qū)分葡萄球菌與微球菌）。
分屬鑒定：
觸酶陽性：進一步做凝固酶試驗（區(qū)分金黃色葡萄球菌與 CoNS）、生化反應。
觸酶陰性：進一步做溶血類型、試驗（區(qū)分肺炎鏈球菌）、血清學分群、BEA 試驗（區(qū)分腸球菌）。
精準確認：對生化不典型菌株或需快速診斷的病例，采用分子生物學技術(shù)或質(zhì)譜技術(shù)。
七、臨床意義：鑒定與抗感染治療的關(guān)聯(lián)
革蘭陽性球菌鑒定的核心目的是指導治療，不同菌種的耐藥性差異極大：
金黃色葡萄球菌：需區(qū)分 MRSA（耐甲氧西林，僅對萬古霉素、利奈唑胺等敏感）與 MSSA（甲氧西林敏感，可選用 β- 內(nèi)酰胺類藥物如苯唑西林）。
腸球菌：需檢測是否為 VRE（耐萬古霉素腸球菌），VRE 感染需選用利奈唑胺、達托霉素等。
鏈球菌：A 群鏈球菌對青霉素敏感；肺炎鏈球菌需檢測青霉素敏感性（部分菌株耐藥）。
因此，精準的菌種鑒定結(jié)合藥敏試驗，是實現(xiàn)“精準抗感染治療”的前提，可有效減少抗生素濫用和耐藥菌產(chǎn)生。
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