大鼠脈絡膜成纖維細胞的原代培養(yǎng)鑒定方法及操作要點！
小楊 / 2025-11-17 09:42:44
一、形態(tài)學鑒定（基礎初篩）
形態(tài)學是最直觀的初步鑒定手段，通過光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)、生長方式，排除明顯雜細胞污染，初步判斷細胞是否符合成纖維細胞的典型特征。
1、光學顯微鏡觀察（倒置相差顯微鏡）
典型形態(tài)特征：
貼壁生長，呈長梭形或多角形，胞體舒展，有明顯的胞質突起（1-2 個主突起，分支少）；
細胞核呈橢圓形或扁圓形，位于細胞中央或偏位，核仁清晰（1-2 個）；
細胞排列具有“方向性”，常呈漩渦狀、束狀或平行排列（原代培養(yǎng)早期可能因細胞來源區(qū)域差異略有分散，傳代 1-2 次后形態(tài)更統(tǒng)一）。
雜細胞排除：
若出現(xiàn)圓形、緊密貼壁且呈“鋪路石樣”排列的細胞，可能是脈絡膜內皮細胞；
若出現(xiàn)多角形、胞質富含色素顆粒的細胞，可能是視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞；
若出現(xiàn)小圓形、懸浮或輕度貼壁的細胞，可能是免疫細胞（如
巨噬細胞、
淋巴細胞）。
2、蘇木精 - 伊紅（HE）染色
用途：進一步清晰觀察細胞結構，區(qū)分細胞核與細胞質，輔助判斷細胞純度。
染色結果：
成纖維細胞細胞核呈藍紫色（蘇木精著色），細胞質呈淡粉紅色（伊紅著色），胞質內無色素顆粒，細胞輪廓及梭形結構更清晰；
雜細胞胞質會因色素顆粒呈現(xiàn)棕褐色，可直接區(qū)分。
二、特異性標志物鑒定（核心驗證：排除雜細胞，確認細胞身份）
成纖維細胞有其獨特的細胞表面標志物或胞質蛋白，通過免疫熒光染色（IF） 或免疫印跡檢測特異性標志物，并結合“陰性標志物”排除雜細胞，是最常用且可靠的鑒定方法。
1、核心陽性標志物（成纖維細胞特異性）
標志物名稱 蛋白功能 檢測方法 陽性結果特征
波形蛋白（Vimentin） 間質細胞特異性中間絲蛋白，成纖維細胞骨架核心成分 IF/WB IF：胞質呈彌漫性綠色（或對應熒光色），沿細胞突起分布；WB：在～57 kDa 處出現(xiàn)特異性條帶
成纖維細胞特異性蛋白 1（FSP1/S100A4） 成纖維細胞分化相關蛋白，調控細胞遷移 IF/WB IF：胞質呈陽性信號，無核染色；WB：在～12 kDa 處出現(xiàn)條帶
α- 平滑肌肌動蛋白（α-SMA） 部分活化成纖維細胞表達，靜止態(tài)成纖維細胞低表達 IF/WB IF：胞質呈絲狀陽性信號；需注意：僅活化態(tài)陽性，靜止態(tài)需結合其他標志物
2、陰性標志物（排除雜細胞污染）
為確保細胞純度，需同時檢測雜細胞的特異性標志物，確認其陰性表達：
脈絡膜內皮細胞：CD31（血小板內皮細胞黏附分子）、von Willebrand 因子（vWF）；
視網(wǎng)膜色素上皮細胞：細胞角蛋白 18/19（CK18/CK19，上皮細胞特異性中間絲蛋白）、RPE65（RPE 細胞特異性視黃醇異構酶）；
免疫細胞：CD45（白細胞共同抗原，淋巴細胞、巨噬細胞均表達）。
3、操作注意事項
IF 檢測：需設置“陽性對照”和“陰性對照”，避免非特異性染色干擾結果；
WB 檢測：需用內參蛋白校正上樣量，確保結果定量準確性。
三、功能特性鑒定（確認細胞活性與功能完整性）
除“身份確認”外，還需驗證原代細胞是否保留成纖維細胞的核心功能，確保其可用于后續(xù)實驗（如細胞信號通路研究、疾病模型構建）。
1、增殖能力鑒定（MTT 法/CCK-8 法）
原理：利用活細胞線粒體脫氫酶將 MTT（或 CCK-8 試劑）還原為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與活細胞數(shù)正相關；
操作：將對數(shù)生長期的細胞接種于 96 孔板，連續(xù) 3-5 天檢測吸光度（MTT 檢測波長 570 nm，CCK-8 檢測波長 450 nm），繪制生長曲線；
結果判斷：成纖維細胞生長曲線呈“S”型，增殖活躍（原代細胞前 3 代增殖能力較強，傳代次數(shù)過多后增殖會減緩），若生長緩慢或停滯，可能提示細胞活力不足。
2、膠原分泌能力鑒定（成纖維細胞核心功能）
成纖維細胞的主要功能是合成并分泌膠原（如 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原），可通過以下方法檢測：
免疫熒光染色：檢測細胞內/細胞外膠原表達，Ⅰ 型膠原（Collagen Ⅰ）陽性信號主要分布于胞質及細胞外基質；
酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）：收集細胞培養(yǎng)上清液，檢測分泌到培養(yǎng)基中的膠原含量，直接反映細胞分泌功能；
天狼星紅染色：對細胞外基質中的膠原進行特異性染色（呈紅色），可通過圖像分析定量膠原沉積量。
3、遷移能力鑒定（劃痕愈合實驗/Transwell 實驗）
劃痕愈合實驗：
細胞長滿培養(yǎng)皿后，用無菌槍頭在細胞層劃一條均勻劃痕，PBS 洗去脫落細胞；
培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h 后觀察劃痕寬度變化，計算“愈合率”（愈合率 =(初始劃痕寬度 - 各時間點劃痕寬度)/初始劃痕寬度 ×100%）；
結果：成纖維細胞具有較強遷移能力，24 h 愈合率通?？蛇_ 30%-50%（具體因細胞活性而異）。
Transwell 實驗：
上室接種細胞（無血清培養(yǎng)基），下室加入含血清的培養(yǎng)基（趨化因子）；
培養(yǎng) 24 h 后，固定下室膜表面的遷移細胞并染色，計數(shù)遷移細胞數(shù)；
結果：成纖維細胞可主動遷移至下室，遷移細胞數(shù)顯著高于陰性對照（如固定的死細胞）。
四、其他輔助鑒定（可選，根據(jù)實驗需求）
1、染色體核型分析
用途：確認細胞為大鼠來源（排除人源或其他動物細胞污染），且核型無明顯變異（原代細胞早期核型應與大鼠正常核型一致，即 42 條染色體，XY/XX）；
適用場景：需長期培養(yǎng)或用于遺傳學相關實驗時。
2、病原體檢測（確保細胞無污染）
檢測項目：細菌（如葡萄球菌、大腸桿菌）、真菌（如酵母菌、霉菌）、支原體（細胞培養(yǎng)常見污染）；
檢測方法：
細菌/真菌：培養(yǎng)法（細胞上清液接種 LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 24-48 h 觀察菌落）或熒光染色法（DAPI 染色，觀察是否有非細胞來源的核酸信號）；
支原體：PCR 法（檢測支原體特異性基因）或支原體檢測試劑盒，確保細胞無支原體污染（支原體會嚴重影響細胞功能，導致實驗結果偏差）。
初步篩選：光學顯微鏡觀察形態(tài)（長梭形、漩渦狀排列），HE 染色排除色素細胞；
核心驗證：免疫熒光/WB 檢測陽性標志物（Vimentin、FSP1）+ 陰性標志物（CD31、CK18、CD45），確認細胞身份及純度；
功能確認：MTT/CCK-8 檢測增殖、ELISA /天狼星紅檢測膠原分泌、劃痕/ Transwell 檢測遷移，確保細胞功能完整；
質量控制：可選染色體核型分析和病原體檢測，滿足特定實驗需求。
通過以上多維度鑒定，可確保培養(yǎng)的細胞為高純度、高活性的原代大鼠脈絡膜成纖維細胞，為后續(xù)實驗提供可靠的細胞模型。
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