煮沸滅菌過程中如何避免培養(yǎng)基被污染？具體措施有哪些？
小楊 / 2025-11-22 13:50:36
百歐博偉生物：煮沸滅菌由于溫度僅為 100℃，滅菌效果有限，且過程中易因操作不當導致污染，需通過嚴格控制細節(jié)減少污染風險，具體措施如下：
一、滅菌前：徹底清潔與預處理
1、容器與工具的無菌化處理
所有接觸培養(yǎng)基的容器（燒杯、錐形瓶等）、工具（玻璃棒、移液管）需先用洗潔精徹底清洗，去除殘留雜質(zhì)，再用純化水沖洗 3 次以上。
清洗后，將容器、工具放入沸水中煮沸 10 分鐘（初步滅菌），或用干熱滅菌（160℃，2 小時），確保表面無雜菌殘留。
2、培養(yǎng)基溶解時的防污染
溶解干粉培養(yǎng)基時，在潔凈環(huán)境中操作（如擦拭后的實驗臺），避免空氣中的塵埃、雜菌落入溶液。
溶解過程中如需攪拌，玻璃棒需提前滅菌，且攪拌時避免觸碰容器外壁或臺面。
二、滅菌中：嚴格控制煮沸與密封狀態(tài)
1、容器密封的有效性
分裝培養(yǎng)基時，容器口需預留 3~5cm 空間，避免煮沸時溢出導致污染。
用滅菌棉塞（提前 121℃高壓滅菌 30 分鐘）塞緊容器口，棉塞長度的 2/3 需塞入瓶口（過松易脫落，過緊影響透氣），外部用雙層牛皮紙緊密包裹并扎緊（防止蒸汽直接浸濕棉塞，導致雜菌附著）。
若使用硅膠塞，需確保塞子與瓶口貼合緊密，且提前用 75% 酒精擦拭消毒。
2、煮沸過程的防污染操作
若采用“水浴煮沸”（容器置于水中），需保證鍋中水位始終低于容器內(nèi)培養(yǎng)基液面，防止外界水進入容器污染培養(yǎng)基。
煮沸時保持小火持續(xù)沸騰，避免劇烈沸騰導致培養(yǎng)基沖出棉塞或牛皮紙，若產(chǎn)生大量泡沫，可輕輕攪拌或短暫關(guān)火降溫。
中途需補充鍋中水分時，應加入沸水（而非冷水），避免溫度驟降導致容器內(nèi)外氣壓差，吸入外界空氣雜菌。
3、避免交叉污染
多個容器同時滅菌時，需保持間距，避免相互擠壓導致棉塞脫落或容器破裂。
若有培養(yǎng)基溢出，需立即關(guān)火，更換污染的容器和棉塞，并用 75% 酒精擦拭周邊區(qū)域。
三、滅菌后：無菌操作與儲存
1、滅菌后轉(zhuǎn)移的無菌保護
煮沸結(jié)束后，待容器稍冷卻（約 5~10 分鐘，避免燙手），立即轉(zhuǎn)移至超凈臺或無菌操作間，避免在開放環(huán)境中長時間放置（空氣中的雜菌可能通過潮濕的棉塞進入）。
轉(zhuǎn)移過程中，避免觸碰容器口及棉塞，若棉塞不慎掉落，需重新更換滅菌棉塞并再次煮沸 30 分鐘。
2、分裝與凝固的無菌控制
若需倒平板，待培養(yǎng)基冷卻至 50~60℃（手感微燙但不燙手）時，在超凈臺中操作：打開容器時，瓶口對著酒精燈火焰消毒 3~5 秒，倒平板動作迅速，避免瓶口長時間暴露。
平板凝固后，立即倒置（防止冷凝水滴落污染表面），標記后置于 4℃冰箱暫存，儲存時間不超過 1 周（煮沸滅菌的培養(yǎng)基營養(yǎng)易流失，且無菌性難以長期維持）。
四、關(guān)鍵原則總結(jié)
煮沸滅菌的核心是減少“滅菌后 - 使用前”的污染機會，因為其本身無法殺滅芽孢，若操作中引入雜菌，極易導致培養(yǎng)失敗。因此，需全程保持“清潔 - 密封 - 無菌轉(zhuǎn)移”的連貫控制，且僅用于對無菌要求極低的場景，嚴格實驗建議優(yōu)先采用高壓蒸汽滅菌。
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