ITC 肉湯培養(yǎng)基的使用方法與操作流程及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-11-25 09:20:22
一、ITC 肉湯培養(yǎng)基原理
ITC 肉湯培養(yǎng)基是一種廣譜性微生物增菌及發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基，核心用于細(xì)菌（尤其是革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽(yáng)性菌）的培養(yǎng)、增殖及碳水化合物發(fā)酵能力鑒定，廣泛應(yīng)用于臨床微生物學(xué)、食品衛(wèi)生檢測(cè)及環(huán)境微生物篩查。其原理圍繞營(yíng)養(yǎng)供給、發(fā)酵反應(yīng)指示及滲透壓平衡設(shè)計(jì)：
1、營(yíng)養(yǎng)成分與功能
胰蛋白胨/大豆蛋白胨：提供蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，作為細(xì)菌生長(zhǎng)的碳源、氮源及維生素來源，滿足多數(shù)異養(yǎng)菌的基礎(chǔ)代謝需求。
葡萄糖/特定碳水化合物：培養(yǎng)基可根據(jù)需求添加葡萄糖、乳糖、蔗糖等單一碳水化合物，作為細(xì)菌發(fā)酵的底物 —— 發(fā)酵型細(xì)菌可通過糖酵解或其他途徑分解碳水化合物，產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸性產(chǎn)物。
氯化鈉：維持培養(yǎng)基滲透壓，模擬細(xì)菌自然生長(zhǎng)環(huán)境，避免細(xì)胞因滲透壓失衡破裂。
指示劑（酚紅）：酚紅為 pH 指示劑，中性條件下呈紅色（pH 6.8-8.4）；細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸使培養(yǎng)基 pH 降至 6.8 以下時(shí)，指示劑變?yōu)辄S色，直觀反映發(fā)酵陽(yáng)性結(jié)果。
2、關(guān)鍵設(shè)計(jì)邏輯
無選擇性抑制劑（如膽鹽、染料），屬于非選擇性培養(yǎng)基，可支持多種細(xì)菌生長(zhǎng)，適用于樣品中目標(biāo)菌的富集培養(yǎng)。
碳水化合物濃度精準(zhǔn)（通常 0.5%-1%），既保證發(fā)酵反應(yīng)的可檢測(cè)性，又避免高濃度糖導(dǎo)致的滲透壓過高抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。
緩沖能力溫和，可維持細(xì)菌生長(zhǎng)初期的 pH 穩(wěn)定，僅在發(fā)酵產(chǎn)酸達(dá)到一定量時(shí)才出現(xiàn)指示劑顏色變化，減少假陽(yáng)性。
二、ITC 肉湯培養(yǎng)基使用方法（含操作流程、注意事項(xiàng)及質(zhì)量控制）
1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
培養(yǎng)基配方（1L）：胰蛋白胨 10g、大豆蛋白胨 3g、氯化鈉 5g、碳水化合物 5g、酚紅 0.025g，蒸餾水 1L（pH 調(diào)至 7.2±0.2，25℃）。
試劑與器材：ITC 肉湯干粉（或自制培養(yǎng)基）、無菌試管、棉塞/硅膠塞、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、接種環(huán)、樣品。
培養(yǎng)基制備：
稱取對(duì)應(yīng)量的干粉（或按自制配方稱量試劑），加入 1L 蒸餾水，攪拌至完全溶解（可加熱至 50℃加速溶解）。
用 1mol/L HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.2±0.2（pH 偏差會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)及指示劑靈敏度）。
分裝至無菌試管（每管 5-10mL，根據(jù)樣品量調(diào)整），加棉塞或硅膠塞（避免密封過緊導(dǎo)致厭氧環(huán)境，影響需氧菌生長(zhǎng)）。
高壓滅菌：121℃、15psi（1.05kg/cm²）滅菌 15 分鐘（碳水化合物易分解，不可過度滅菌，否則會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基變色、營(yíng)養(yǎng)失效）。
滅菌后取出，冷卻至 45-50℃，待培養(yǎng)基凝固（若為液體肉湯則無需凝固，直接冷卻至室溫備用），檢查外觀：應(yīng)為澄清紅色液體，無渾濁、沉淀或顏色異常（若出現(xiàn)黃色，可能是滅菌時(shí) pH 下降或污染，需廢棄）。
2、接種與培養(yǎng)
樣品處理：
固體樣品：稱取 10g 樣品，加入 90mL 無菌生理鹽水，勻漿制成 1:10 稀釋液；液體樣品可直接使用，或按 1:10 稀釋（減少樣品中抑制物濃度）。
臨床標(biāo)本：用無菌注射器抽取 0.5-1mL，直接接種（無需稀釋，保證菌量）。
接種操作：
無菌操作下，取 0.1-0.5mL 處理后的樣品，加入 ITC 肉湯試管中（樣品與培養(yǎng)基體積比約 1:10，避免樣品濃度過高抑制生長(zhǎng)）。
用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)菌落時(shí)，需將菌落充分混懸于肉湯中，避免結(jié)塊（保證細(xì)菌均勻接觸營(yíng)養(yǎng)成分）。
培養(yǎng)條件：
需氧菌：35-37℃恒溫培養(yǎng) 18-24 小時(shí)（多數(shù)致病菌的最適生長(zhǎng)溫度）；若為緩慢生長(zhǎng)菌（如
結(jié)核分枝桿菌），可延長(zhǎng)至 48-72 小時(shí)。
厭氧菌：需在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（ITC 肉湯本身無厭氧支持，需額外提供厭氧環(huán)境，如加入還原劑或使用厭氧袋）。
3、結(jié)果觀察與判定
生長(zhǎng)情況判斷：培養(yǎng)基渾濁（細(xì)菌增殖導(dǎo)致）表示有細(xì)菌生長(zhǎng)；若仍澄清，可能是樣品中無目標(biāo)菌或細(xì)菌未生長(zhǎng)（需排查培養(yǎng)基質(zhì)量或培養(yǎng)條件）。
發(fā)酵反應(yīng)判定：
陽(yáng)性（+）：培養(yǎng)基變?yōu)辄S色（產(chǎn)酸），部分細(xì)菌發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣體（如大腸桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣），可觀察到試管內(nèi)有氣泡或棉塞被頂起。
陰性（-）：培養(yǎng)基仍為紅色，無渾濁或輕微渾濁（細(xì)菌生長(zhǎng)但不發(fā)酵目標(biāo)碳水化合物）。
可疑（±）：培養(yǎng)基呈橙色（pH 介于 6.8-7.2），需延長(zhǎng)培養(yǎng) 12-24 小時(shí)后重新觀察，避免因發(fā)酵產(chǎn)酸不足導(dǎo)致假陰性。
4、注意事項(xiàng)（關(guān)鍵操作要點(diǎn)）
無菌控制：培養(yǎng)基制備、分裝、接種全程需無菌操作，避免環(huán)境雜菌污染（尤其是發(fā)酵試驗(yàn)，雜菌可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果）。
pH 控制：滅菌后培養(yǎng)基 pH 可能略有下降（≤0.2），若下降過多（如 pH<6.8），需重新調(diào)整配方并滅菌；使用前若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基已變黃，直接廢棄。
樣品接種量：不可超過培養(yǎng)基體積的 1/10，否則樣品中的抑制物會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)，同時(shí)導(dǎo)致 pH 異常。
培養(yǎng)溫度：嚴(yán)格控制在 35-37℃（偏離溫度會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢或發(fā)酵能力下降，如低溫可能使發(fā)酵反應(yīng)延遲）。
指示劑穩(wěn)定性：酚紅對(duì)光敏感，培養(yǎng)基需避光保存（4℃冰箱，密封），避免光照導(dǎo)致顏色變淺或失效，保存期一般不超過 1 個(gè)月。
5、質(zhì)量控制（QC 要點(diǎn)）
無菌試驗(yàn)：每批培養(yǎng)基滅菌后，取 1-2 管不接種樣品，同條件培養(yǎng) 18-24 小時(shí)，若培養(yǎng)基澄清無渾濁，說明無菌合格；若渾濁，需排查滅菌過程或器材污染。
生長(zhǎng)促進(jìn)試驗(yàn)：接種已知的營(yíng)養(yǎng)要求較低的細(xì)菌（如
大腸桿菌 ATCC 25922），37℃培養(yǎng) 18 小時(shí)，應(yīng)出現(xiàn)明顯渾濁（生長(zhǎng)良好），且發(fā)酵葡萄糖呈黃色（陽(yáng)性對(duì)照）。
發(fā)酵特異性試驗(yàn)：接種不發(fā)酵目標(biāo)碳水化合物的細(xì)菌（如
金黃色葡萄球菌 ATCC 25923，不發(fā)酵乳糖），培養(yǎng)后培養(yǎng)基仍為紅色（陰性對(duì)照），說明指示劑無假陽(yáng)性反應(yīng)。
pH 驗(yàn)證：滅菌后隨機(jī)抽取 3-5 管，用 pH 計(jì)測(cè)定 pH，需在 7.0-7.4 之間（25℃），偏差超過 0.2 需重新制備。
三、應(yīng)用場(chǎng)景
臨床微生物檢測(cè)：用于尿液、糞便、血液等標(biāo)本中致病菌的增菌及發(fā)酵鑒定（如尿路感染中大腸桿菌的篩查，通過發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣確診）。
食品衛(wèi)生檢測(cè)：檢測(cè)食品中腸道致病菌（如
沙門氏菌、
志賀氏菌），先經(jīng) ITC 肉湯增菌后，再用選擇性培養(yǎng)基分離純化。
環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)：篩查水體、土壤中可發(fā)酵碳水化合物的細(xì)菌，評(píng)估環(huán)境微生物污染程度。
細(xì)菌分類鑒定：作為細(xì)菌生化鑒定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加不同碳水化合物，測(cè)定細(xì)菌的發(fā)酵譜，輔助細(xì)菌屬種鑒定。
四、常見問題與解決方案
問題 1：培養(yǎng)基接種后無渾濁（細(xì)菌不生長(zhǎng)）。
解決方案：檢查培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分；排查樣品中是否有高濃度抑制物，可稀釋樣品后重新接種；確認(rèn)培養(yǎng)溫度和時(shí)間是否符合細(xì)菌生長(zhǎng)要求。
問題 2：發(fā)酵試驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性（非目標(biāo)菌導(dǎo)致變黃）。
解決方案：嚴(yán)格無菌操作，減少環(huán)境雜菌污染；縮短樣品處理時(shí)間（避免雜菌在樣品中增殖）；使用新鮮制備的培養(yǎng)基（避免保存過久導(dǎo)致雜菌污染）。
問題 3：培養(yǎng)基渾濁但顏色不變（生長(zhǎng)陽(yáng)性，發(fā)酵陰性）。
解決方案：確認(rèn)目標(biāo)細(xì)菌是否能發(fā)酵該碳水化合物；延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間（部分細(xì)菌發(fā)酵速度較慢）；檢查碳水化合物是否添加正確。
通過以上原理、操作流程及質(zhì)量控制要點(diǎn)，可確保
ITC 肉湯培養(yǎng)基在微生物培養(yǎng)及發(fā)酵鑒定中的準(zhǔn)確性和可靠性，適用于科研、臨床及工業(yè)檢測(cè)等多個(gè)場(chǎng)景。
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