西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基制作的具體步驟及注意事項有哪些？
小楊 / 2025-12-06 10:07:26
西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基的制作需遵循嚴格的稱量、溶解、分裝、滅菌及凝固成型流程，核心是確保各成分均勻混合、滅菌徹底，同時維持培養(yǎng)基的 pH 和凝固形態(tài)（斜面），具體步驟可分為以下 6 個階段，每個環(huán)節(jié)需注意操作細節(jié)以保證試驗準確性：
一、實驗前準備
1、材料與器具核對
確認所需試劑：西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基干粉（或各單一組分，如氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫銨、磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、溴麝香草酚藍、瓊脂）、蒸餾水（或去離子水）。
準備器具：電子天平（精度 0.1g）、1L 燒杯、玻璃棒、量筒（1L）、試管（15mm×150mm 或類似規(guī)格）、試管架、高壓蒸汽滅菌器、pH 試紙（或 pH 計）、錐形瓶（帶棉塞/硅膠塞）。
環(huán)境要求：在無菌操作區(qū)（如超凈臺附近）或潔凈工作臺進行，避免灰塵污染；器具需提前清洗并干燥（玻璃器皿可先 121℃干熱滅菌 2h，或隨培養(yǎng)基一同濕熱滅菌）。
2、試劑稱量（以配制 1L 培養(yǎng)基為例）
若使用預混干粉（市售常見形式）：直接稱取干粉 25.3g（不同廠家配方可能略有差異，需參照產(chǎn)品說明書調整，核心是確保各成分比例準確）。
若使用單一組分：按以下劑量精確稱量（誤差需≤0.1g，避免影響碳氮源濃度或 pH）：
氯化鈉（NaCl）：5.0g
硫酸鎂（MgSO??7H?O）：0.2g
磷酸二氫銨（NH?H?PO?）：1.0g
磷酸氫二鉀（K?HPO?）：1.0g
檸檬酸鈉（Na?C?H?O??2H?O）：5.0g
溴麝香草酚藍（指示劑）：0.008g（可先溶于少量乙醇再加入，避免結塊）
瓊脂：15.0g（確保為微生物級瓊脂，無雜質）。
二、溶解與 pH 調節(jié)
1、溶解培養(yǎng)基
將稱量好的干粉（或單一組分混合物）倒入 1L 燒杯中，加入約 800mL 蒸餾水（先加少量水攪拌至粉末濕潤，避免結塊），用玻璃棒充分攪拌均勻。
將燒杯置于石棉網(wǎng)或電熱板上，小火加熱煮沸，期間持續(xù)攪拌（防止瓊脂粘底燒焦），直至瓊脂完全溶解（溶液呈透明狀，無白色絮狀物或顆粒），此時補加蒸餾水至總容積 1L（加熱過程中會蒸發(fā)部分水分，需補至標準體積）。
2、pH 校準（關鍵步驟）
待溶液冷卻至 50-60℃（手觸燒杯壁不燙手），用 pH 試紙或 pH 計測定 pH 值，要求最終 pH 為6.8±0.2。
若 pH 偏低（<6.6）：滴加少量 1mol/L NaOH 溶液，邊加邊攪拌，每加 1-2 滴后重新測定 pH，直至達標；
若 pH 偏高（>7.0）：滴加少量 1mol/L HCl 溶液調節(jié)，避免過量導致 pH 劇烈波動（影響細菌生長和指示劑反應）。
三、分裝試管
1、分裝量控制
將調節(jié)好 pH 的培養(yǎng)基溶液趁熱分裝到潔凈試管中，每支試管分裝1/5-1/4 試管高度（約 3-5mL），避免分裝過多（滅菌后斜面過長易污染）或過少（生長面積不足）。
分裝時用玻璃棒引流（或使用分裝漏斗），避免溶液沾到試管口（殘留培養(yǎng)基會導致滅菌后試管口粘連，且易滋生雜菌）。
2、加塞與標記
每支試管加棉塞（或硅膠塞），棉塞需松緊適宜：過松易污染，過緊滅菌后難以拔出；棉塞長度約 1/3 在試管內(nèi)、2/3 在試管外，并用牛皮紙或報紙包裹試管口（防止滅菌時冷凝水浸濕棉塞）。
四、高壓蒸汽滅菌（核心滅菌環(huán)節(jié)）
1、滅菌參數(shù)設定
將分裝好的試管放入高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，排列整齊（避免試管傾倒），關閉滅菌器門，檢查排氣閥、安全閥是否正常。
設定滅菌條件：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²）、滅菌 15min（溫度和時間需嚴格控制：溫度不足或時間過短會導致雜菌未被殺滅，溫度過高或時間過長會破壞培養(yǎng)基中的檸檬酸鹽或指示劑）。
2、滅菌操作流程
先打開排氣閥，加熱至蒸汽連續(xù)排出（排除滅菌器內(nèi)冷空氣，冷空氣殘留會導致局部溫度不足），關閉排氣閥，待壓力和溫度升至設定值后開始計時。
滅菌結束后，關閉熱源，待滅菌器內(nèi)壓力自然降至 0kPa（不可強行放氣，避免培養(yǎng)基暴沸沖出試管），打開排氣閥，取出試管，置于試管架上冷卻。
五、制作斜面（凝固成型）
1、斜面制作時機
待試管內(nèi)培養(yǎng)基冷卻至50-60℃（此時培養(yǎng)基仍呈液態(tài)，但已開始降溫，不燙手且不易凝固），立即將試管傾斜放置在斜面架上（或用書本、支架支撐試管，使試管口略高于管底），形成斜面。
斜面長度控制：斜面頂端距離試管口約 1-2cm，斜面底部不超過試管總長度的 1/2（確保生長面積充足，且冷凝水可回流至管底，不浸泡斜面）。
2、凝固與檢查
待培養(yǎng)基完全冷卻凝固（約 30-60min，室溫下自然凝固，避免放入冰箱加速凝固導致斜面開裂），觀察斜面形態(tài)：應光滑、無氣泡、無裂紋，顏色為均勻的淺綠色（溴麝香草酚藍在 pH6.8 時的顏色）。
若發(fā)現(xiàn)斜面有氣泡、污染斑點或顏色異常（如變藍、變黃），需丟棄，不可使用。
六、滅菌效果驗證與儲存
1、無菌驗證（可選，推薦做）
隨機選取 1-2 支制備好的斜面，不接種細菌，置于 36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24-48h，若斜面無任何菌落生長，說明滅菌合格；若有雜菌生長，需重新檢查滅菌流程并重新制備。
2、儲存條件
合格的斜面培養(yǎng)基需密封（試管口可套無菌塑料袋），置于4-8℃冰箱中避光儲存，儲存時間不超過 2 周（長時間儲存會導致培養(yǎng)基失水干燥，或指示劑緩慢變色，影響試驗結果）。
使用前需將培養(yǎng)基從冰箱取出，恢復至室溫（約 30min），再進行接種操作。
3、關鍵注意事項總結
檸檬酸鹽是唯一碳源，需確保稱量準確，避免因碳源不足導致細菌無法生長；
溴麝香草酚藍為光敏性指示劑，滅菌后需避光儲存，防止提前變色；
斜面制作時溫度需適宜，過冷易凝固結塊，過熱易導致試管破裂；
整個過程需避免污染，尤其是分裝、加塞和滅菌后取放環(huán)節(jié)，否則會干擾后續(xù)細菌鑒定結果。
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