大鼠原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的方法及操作步驟！
小楊 / 2026-01-08 09:41:20
大鼠原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇，核心目標(biāo)是維持細(xì)胞活性和內(nèi)皮細(xì)胞特異性表型，操作需嚴(yán)格遵循“慢凍快融”的基本原則，具體步驟和注意事項如下：
一、細(xì)胞凍存方法
1、凍存前準(zhǔn)備
細(xì)胞狀態(tài)要求：選擇對數(shù)生長期、融合度 70%-80% 的細(xì)胞，此時細(xì)胞活性最佳；確保細(xì)胞無微生物污染（細(xì)菌、真菌、支原體），無形態(tài)異常。
試劑與耗材
凍存液：推薦使用完全培養(yǎng)基：胎牛血清：FBS: 二甲基亞砜 (DMSO)=6:3:1的配方，DMSO 需為細(xì)胞培養(yǎng)級，避免雜質(zhì)毒性；凍存液需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制過程置于冰上，減少 DMSO 對細(xì)胞的損傷。
耗材：無菌凍存管（標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期）、移液管、離心管；凍存盒（含異丙醇，用于梯度降溫）。
其他：0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液、完全培養(yǎng)基、PBS、冰浴裝置。
2、操作步驟
細(xì)胞消化：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，加入適量胰蛋白酶 - EDTA 消化液，37℃孵育 1-3min；鏡下觀察到細(xì)胞變圓、間隙增大時，立即加入 2 倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化。
細(xì)胞收集：用移液管輕柔吹打瓶壁，使細(xì)胞完全脫落，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管，1000r/min 室溫離心 5min。
細(xì)胞重懸：棄去上清，輕輕彈擊離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散；加入預(yù)冷的凍存液，輕柔吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10? - 5×10? 個 /mL。
分裝凍存：將細(xì)胞懸液分裝至凍存管，每管 1mL，旋緊管蓋，做好標(biāo)記。
梯度降溫
方法 1（常規(guī)法）：將凍存管放入含異丙醇的凍存盒，置于 - 80℃冰箱過夜（降溫速率約 - 1℃/min）；次日迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐（-196℃）長期保存。
方法 2（簡化法）：無凍存盒時，可按4℃ 30min→-20℃ 1h→-80℃ 過夜→液氮的步驟梯度降溫，避免溫度驟降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶形成。
3、凍存注意事項
DMSO 具有滲透性和毒性，需在冰上操作，且避免與皮膚直接接觸；細(xì)胞與 DMSO 接觸時間不宜超過 30min，防止細(xì)胞損傷。
液氮保存時，需定期檢查液氮量，確保凍存管完全浸沒在液氮中；凍存管取出時需佩戴防凍手套，防止凍傷。
二、細(xì)胞復(fù)蘇方法
1、復(fù)蘇前準(zhǔn)備
試劑預(yù)熱：提前將完全培養(yǎng)基置于 37℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱，避免冷培養(yǎng)基刺激復(fù)蘇后的細(xì)胞。
耗材準(zhǔn)備：無菌培養(yǎng)瓶（提前用明膠或多聚賴氨酸包被）、移液管、離心管；37℃水浴鍋（提前預(yù)熱，水面沒過凍存管高度的 2/3）。
2、操作步驟
快速解凍：從液氮罐中取出凍存管，迅速投入 37℃水浴鍋中，快速、輕柔搖晃凍存管，使管內(nèi)凍存液在 1-2min 內(nèi)完全融化（嚴(yán)禁超過 3min，防止 DMSO 損傷細(xì)胞）。
無菌處理：將凍存管轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，用 75% 乙醇擦拭管壁消毒，開蓋。
細(xì)胞轉(zhuǎn)移與離心：用移液管將細(xì)胞懸液緩慢轉(zhuǎn)移至含預(yù)熱完全培養(yǎng)基的離心管中（培養(yǎng)基體積至少為凍存液的 5 倍，稀釋 DMSO 濃度），輕輕混勻；1000r/min 室溫離心 5min，棄去上清，去除殘留 DMSO。
細(xì)胞接種：加入適量預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，使其均勻重懸；將細(xì)胞懸液接種至包被好的培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分布。
培養(yǎng)孵育：將培養(yǎng)瓶置于 37℃、5% CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24h 內(nèi)禁止移動或換液，保證細(xì)胞貼壁。
換液與觀察：培養(yǎng) 24-48h 后，鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，吸棄舊培養(yǎng)基（去除未貼壁的死細(xì)胞），加入新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
3、復(fù)蘇注意事項
復(fù)蘇的核心是快融，目的是減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對細(xì)胞膜的機(jī)械損傷，解凍時間越短越好。
離心后棄上清時，需輕柔操作，避免吸走細(xì)胞沉淀；接種密度不宜過低，否則原代細(xì)胞易凋亡。
復(fù)蘇后若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁率低，可適當(dāng)提高培養(yǎng)基中血清濃度（至 20%）或添加內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ECGS），促進(jìn)細(xì)胞增殖。
三、凍存復(fù)蘇后的質(zhì)量控制
活性檢測：采用臺盼藍(lán)染色法，活細(xì)胞排斥臺盼藍(lán)，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞率應(yīng)≥80%，低于此標(biāo)準(zhǔn)則細(xì)胞復(fù)蘇失敗。
純度鑒定：復(fù)蘇后培養(yǎng)至第 2 代，采用 CD31 或 vWF 免疫熒光染色鑒定，陽性率需≥90%，確保無雜細(xì)胞污染。
形態(tài)觀察：鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，正常的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)呈梭形或多角形，融合后呈鋪路石樣排列，無明顯變形或空泡化。
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