兔主動脈平滑肌細胞的原代分離與培養(yǎng)操作步驟及質(zhì)量控制！
小楊 / 2026-01-29 09:30:10
一、前期準備（核心質(zhì)控：試劑/耗材無菌驗證）
1、實驗動物
2月齡健康日本大耳白兔（體重 1.5-2.0kg），雌雄不限，無心血管疾病、無感染；實驗前禁食 12h、禁水 4h，符合動物倫理審批。
2、環(huán)境與設(shè)備
生物安全柜（BSL-1）提前 30min 開紫外滅菌 + 風(fēng)機運行；CO?培養(yǎng)箱預(yù)熱至37℃、5% CO?、飽和濕度；離心機預(yù)冷至 4℃；所有操作在冰盒旁進行（減少組織細胞損傷）。
二、組織貼塊法（優(yōu)選，RASMC 純度≥90%，操作容錯率高）
步驟 1：動物處死后無菌取材（全程≤30min，減少組織缺血）
白兔耳緣靜脈注射過量戊巴比妥鈉（100mg/kg）麻醉處死后，立即將兔仰臥固定，75% 酒精反復(fù)擦拭胸腹部皮膚（范圍≥15cm×15cm），無菌紗布覆蓋。
生物安全柜內(nèi)，用無菌手術(shù)刀逐層切開胸腹部皮膚、肌肉，暴露胸腔和腹腔，小心分離出胸主動脈 + 腹主動脈（從主動脈弓至髂總動脈分叉處），用無菌彎鑷輕輕夾取血管壁（避免夾破血管腔）。
立即將血管放入盛有預(yù)冷無鈣鎂 HBSS的無菌培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗 2-3 次，去除表面殘留的血液、筋膜和結(jié)締組織。
步驟 2：血管組織純化（核心：去除內(nèi)皮和外膜，僅保留中膜）
用無菌眼科鑷將血管平鋪于培養(yǎng)皿中，用另一把鑷尖輕輕剝離外膜（白色疏松脂肪纖維層，從一端向另一端撕拉，盡量撕凈，外膜殘留會導(dǎo)致成纖維細胞污染）。
用眼科剪將血管縱行剪開，使血管壁平鋪成薄膜狀，用無菌鑷尖輕輕刮擦內(nèi)膜面（朝向血管腔的一側(cè)）3-5 次，去除單層內(nèi)皮細胞（內(nèi)膜殘留會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞污染）。
再次用預(yù)冷無鈣鎂 HBSS 漂洗純化后的血管中膜 2 次，確認無血跡、無外膜/內(nèi)膜殘留后，備用。
步驟 3：組織塊制備（尺寸均勻，保證細胞游出效率）
用無菌眼科剪將純化的血管中膜剪成1mm×1mm 的細小組織塊，剪的過程中不斷用 HBSS 濕潤，避免組織干燥。
將組織塊用無菌吸頭輕輕轉(zhuǎn)移至另一無菌培養(yǎng)皿中，用吸頭吸去多余，使組織塊呈半干狀態(tài)（利于貼壁）。
步驟 4：組織塊接種與貼壁（關(guān)鍵：倒置培養(yǎng)，避免組織塊漂?。?/strong>
取 T25 無菌培養(yǎng)瓶（若細胞貼壁差，可提前用 0.1% 明膠溶液包被，37℃孵育 2h 后吸去多余明膠，晾干備用），將組織塊均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底部，每瓶放置 20-30 塊（間距≥0.5cm，避免重疊）。
將培養(yǎng)瓶倒置放入 CO?培養(yǎng)箱，37℃、5%CO?孵育2-4h，使組織塊與培養(yǎng)瓶壁充分貼附（此階段嚴禁晃動培養(yǎng)瓶）。
孵育結(jié)束后，在生物安全柜內(nèi)，緩慢沿培養(yǎng)瓶壁加入 5mL 預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（避免直接沖淋組織塊導(dǎo)致脫落），然后將培養(yǎng)瓶正置，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
步驟 5：原代細胞培養(yǎng)與換液（前 7 天為細胞游出關(guān)鍵期，減少干擾）
首次換液：接種后3-4 天首次全量換液，吸去舊培養(yǎng)基（輕輕操作，避免吸走組織塊），加入 5mL 新鮮完全培養(yǎng)基，去除未貼壁的組織殘渣和死細胞。
常規(guī)換液：首次換液后，每 2-3 天全量換液 1 次，鏡下觀察可見細胞從組織塊邊緣游出（梭形/多角形，貼壁生長）。
細胞匯合：接種后 7-10 天，游出的細胞可生長至 80%-90% 匯合，此時可進行首次傳代；未匯合前嚴禁傳代，避免細胞密度過低導(dǎo)致生長緩慢。
三、酶消化法（批量獲取細胞，適合后續(xù)高通量實驗，需嚴格控制酶解時間）
步驟 1-3：同組織貼塊法（動物取材→血管純化→組織預(yù)處理）
差異：血管中膜剪碎為2-3mm×2-3mm 小塊，無需半干處理，直接轉(zhuǎn)入無菌離心管。
步驟 4：雙酶聯(lián)合消化（核心：溫度 + 時間精準控制，避免細胞過度損傷）
向裝有血管組織塊的離心管中加入5mL 預(yù)溫的膠原酶 Ⅰ+ 彈性蛋白酶混合液（2mg/mL+0.5mg/mL），輕輕吹打混勻，37℃恒溫水浴搖床低速振蕩消化 1-1.5h（轉(zhuǎn)速 60-80rpm）。
鏡下觀察：組織塊邊緣模糊、呈絮狀時，立即加入5mL 完全培養(yǎng)基（含 20% FBS）終止消化（消化超時會導(dǎo)致細胞活性大幅下降）。
步驟 5：細胞懸液制備與接種
將消化后的混合液用200 目無菌濾網(wǎng)過濾至新的無菌離心管，去除未消化的組織殘渣，收集單細胞懸液。
4℃、1000rpm 離心 5min，棄上清，用3mL 完全培養(yǎng)基輕輕重懸細胞沉淀（吹打 3-5 次，避免吹打過度導(dǎo)致細胞破裂）。
將細胞懸液接種至 T25 培養(yǎng)瓶，補加完全培養(yǎng)基至 5mL，輕輕搖勻，放入 CO?培養(yǎng)箱37℃、5%CO?培養(yǎng)。
步驟 6：原代細胞培養(yǎng)與換液
首次換液：接種后24h首次換液，吸去未貼壁的死細胞和細胞碎片，加入新鮮完全培養(yǎng)基。
常規(guī)培養(yǎng)：每 2 天換液 1 次，接種后 3-5 天細胞可生長至 80%-90% 匯合，進行首次傳代（酶消化法細胞游出快，但純度略低于組織貼塊法，需通過差速貼壁進一步純化）。
四、首次傳代操作（原代 RASMC 關(guān)鍵傳代，控制消化時間）
吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用無菌 PBS 輕輕漂洗細胞層 2 次，吸去 PBS（去除殘留血清，避免抑制胰酶活性）。
加入1mL 0.25% 胰酶 - EDTA，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使胰酶均勻覆蓋細胞層，37℃孵育1-2min。
鏡下觀察：細胞收縮變圓、間隙增大時，立即加入2mL 完全培養(yǎng)基終止消化，用無菌吸頭輕輕吹打細胞層（從培養(yǎng)瓶壁一側(cè)向另一側(cè)吹打，避免用力刮擦），使細胞完全脫落，形成單細胞懸液。
將細胞懸液轉(zhuǎn)入無菌離心管，4℃、1000rpm 離心 5min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細胞，按1:2-1:3的比例接種至新的培養(yǎng)瓶，補加培養(yǎng)基后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
傳代后 24h 觀察細胞貼壁情況，貼壁率≥85% 為合格，隨后恢復(fù)每 2-3 天換液的常規(guī)培養(yǎng)。
五、原代培養(yǎng)核心質(zhì)控要點（全程把控，保證細胞純度與活性）
無菌質(zhì)控：所有操作在生物安全柜內(nèi)進行，手術(shù)器械每用 1 次用 75% 酒精擦拭滅菌；培養(yǎng)基接種后留取 1mL 空白樣，培養(yǎng) 7 天無渾濁為無菌合格。
純度質(zhì)控：原代 P1 代細胞用 α-SMA 免疫熒光染色，陽性率≥90%；若出現(xiàn)內(nèi)皮/成纖維細胞污染，通過差速貼壁純化（內(nèi)皮細胞貼壁慢，接種后 30min 吸走懸液，重新接種）。
活性質(zhì)控：臺盼藍染色檢測活細胞率，原代游出細胞/酶消化細胞活細胞率≥90%；復(fù)蘇后 24h 貼壁率≥85%。
形態(tài)質(zhì)控：鏡下觀察細胞為典型梭形，核居中卵圓形，匯合后呈柵欄狀/旋渦狀排列，若出現(xiàn)形態(tài)異常（多角形、梭形消失），立即丟棄（避免傳代后表型改變）。
六、操作關(guān)鍵注意事項（避坑重點，減少實驗失?。?/strong>
取材全程快速、低溫、無菌，從動物處死后到血管放入預(yù)冷 HBSS 的時間≤30min，缺血時間過長會導(dǎo)致細胞凋亡。
血管純化是純度決定步驟：外膜必須撕凈（脂肪纖維層），內(nèi)膜輕刮即可（過度刮擦?xí)p傷中膜平滑肌細胞）。
組織貼塊法的倒置孵育和半干貼壁是關(guān)鍵，此階段嚴禁晃動培養(yǎng)瓶，否則組織塊脫落會導(dǎo)致細胞游出失敗。
胰酶消化寧短勿長：RASMC 為貼壁緊密的平滑肌細胞，消化 1-2min 即可，超時會導(dǎo)致細胞膜損傷，細胞貼壁能力下降。
原代細胞低血清易生長緩慢，必須用 20% 優(yōu)質(zhì) FBS（優(yōu)選胎牛血清，批次驗證后使用），避免用小牛血清或低濃度血清。
原代 RASMC 建議使用P3-P8 代進行實驗，傳代超過 10 代后細胞會從收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，表型改變，實驗結(jié)果不可靠。
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