MEF P3細(xì)胞培養(yǎng)Protocol
MEF細(xì)胞鋪制：
一. 作為【小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS 細(xì)胞】用飼養(yǎng)層時(shí)的使用方法：
1,在T25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中至少放置15 min以上。
2,吸除0.2%明膠，加入事先水浴加熱至37℃的MEF完全培養(yǎng)液。一般地，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶中約加入5 ml MEF完全培養(yǎng)液。
3,按實(shí)驗(yàn)需要：mES使用KM-r P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF或都使用CF-1-r P3 MEF，復(fù)蘇MEF細(xì)胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取4,出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
5,將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含2 ml MEF完全培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心5 min，離心后將上清液吸除，按照MEF細(xì)胞說(shuō)明書(shū)上建議的復(fù)蘇培養(yǎng)體系，另加入新鮮的MEF完全培養(yǎng)液2 ml，重懸后平均加入到T25培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h以后可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠iPS細(xì)胞。
二. 作為【人胚胎干細(xì)胞】用飼養(yǎng)層時(shí)的使用方法：
1,在T25培養(yǎng)瓶中加入5%Matrigel，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置30 min以上。
2,吸除Matrigel，加入事先水浴加熱至37℃的MEF完全培養(yǎng)液。一般地，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶中加入5 ml MEF完全培養(yǎng)液。
3,按實(shí)驗(yàn)需要復(fù)蘇CF-1-r P3 MEF若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4,將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含2 ml MEF完全培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心5 min，離心后將上清液吸除，按照MEF細(xì)胞說(shuō)明書(shū)上建議的復(fù)蘇培養(yǎng)體系，另加入新鮮的MEF完全培養(yǎng)液2 ml，重懸后平均加入到T25培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h以后可以傳入人胚胎干細(xì)胞。