一、背景
人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞是建自一個(gè)日本病人的外科手術(shù)的原位組織樣品。電鏡觀察表明，在SiHa細(xì)胞連接處有典型的橋粒，在SiHa細(xì)胞胞質(zhì)中有豐富的張力絲。在裸鼠中，SiHa細(xì)胞能形成低分化的表皮樣癌(Ⅲ級(jí))；SiHa細(xì)胞中，癌基因PRB和p53陽(yáng)性。
二、人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL*培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞傳代：如果人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3）人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
三、應(yīng)用
人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞可以用于子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡及間質(zhì)重構(gòu)機(jī)制的研究：
通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡（apoptosis）、細(xì)胞增殖、細(xì)胞外間質(zhì)成分及部分相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡和間質(zhì)重構(gòu)的機(jī)制及與腫瘤侵襲性生長(zhǎng)的關(guān)系。
方法：應(yīng)用原位末端標(biāo)記法（TUNEL）、雙重?zé)晒饷庖呷旧燃夹g(shù)對(duì)正常子宮頸組織及不同分化程度的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)控基因caspase-3、caspase-8、Bax、Bc1-2、Fas、Fasl蛋白的表達(dá)和間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、纖粘連蛋白（FN）、層粘連蛋白（LN）及相關(guān)調(diào)控金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2、MT1-MMP、TIMP-2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，利用共聚焦顯微鏡觀察熒光染色結(jié)果。
結(jié)果：TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，每例標(biāo)本均有不同程度的細(xì)胞凋亡及PCNA的表達(dá)，但陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及分布區(qū)域不完全相同。在正常子宮頸組織中，凋亡細(xì)胞主要分布于鱗狀上皮上1/3層，而PCNA陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于鱗狀上皮下1/3層；鱗狀上皮下細(xì)胞外間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)結(jié)構(gòu)致密的Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，Ⅳ型膠原和LN蛋白呈線狀環(huán)繞于血管及上皮下基底膜內(nèi)，F(xiàn)N呈細(xì)條索狀分布于基底膜和間質(zhì)內(nèi)。鱗狀上皮中下層細(xì)胞、少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞可見(jiàn)MMP-1、MMP-2、MT1-MMP、TIMP-2較弱熒光。正常子宮頸及鱗狀細(xì)胞癌組織中均有caspase-3、Fas、FasL蛋白的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)域與同一標(biāo)本的凋亡細(xì)胞一致。
鱗狀細(xì)胞癌組織中，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及幾種細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)均明顯增多，癌細(xì)胞分化程度越低，蛋白表達(dá)越明顯。雙重?zé)晒馊旧@示，部分間質(zhì)及腫瘤細(xì)胞可見(jiàn)caspase-3或Fas蛋白與凋亡同時(shí)陽(yáng)性染色，與Bax雙染的細(xì)胞主要是一些間質(zhì)細(xì)胞。正常子宮頸及鱗狀細(xì)胞癌組織中未發(fā)現(xiàn)caspase-8和Bcl-2蛋白表達(dá)。
子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，三型膠原表現(xiàn)為明顯降解：Ⅰ、Ⅲ型膠原結(jié)構(gòu)稀疏，排列紊亂；癌細(xì)胞團(tuán)周圍基底膜內(nèi)的Ⅳ型膠原的線狀熒光減弱、斷裂甚至缺失，尤其以低分化鱗狀細(xì)胞癌明顯，F(xiàn)N和LN蛋白表達(dá)增多，并與癌細(xì)胞分化程度負(fù)相關(guān)。
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