一、背景
人膜間皮細胞是用pRSV-T質(zhì)粒(含有SV40早期區(qū)域和勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列的SV40 ori構(gòu)建體)轉(zhuǎn)染細胞并克隆。間皮細胞從非癌個體獲得的胸膜液中分離。
二、人膜間皮細胞培養(yǎng)操作規(guī)程
1、人膜間皮細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備Medium 199培養(yǎng)基(添加NaHCO3 1.5g/L,3.3 nM EGF，400 nM氫化可的松，870 nM牛胰島素，20 mM HEPES，3.87μg/L H2SeO3)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）人膜間皮細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）人膜間皮細胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、人膜間皮細胞處理：
1）復(fù)蘇人膜間皮細胞：將含有1mL人膜間皮細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有人膜間皮細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查人膜間皮細胞密度。
2）人膜間皮細胞傳代：如果人膜間皮細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁人膜間皮細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗人膜間皮細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若人膜間皮細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細胞的培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.移入到事先準備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3）人膜間皮細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，先要消化處理并進行細胞計數(shù)。消化方法按照細胞傳代方法的1-3步驟進行，最后的重懸液使用血清。懸浮人膜間皮細胞直接計數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。
三、應(yīng)用
人膜間皮細胞可以用于苦參堿抑制TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化機制的研究：
通過探索苦參堿對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導的人腹膜間皮細胞EMT的影響,為防治腹膜纖維化藥物的研發(fā)提供科學依據(jù)。
方法：采用5ng/ml的TGF-β1誘導人腹膜間皮細胞使其發(fā)生EMT,同時給予不同濃度的苦參堿(0.4、0.6、0.8和1.0mg/ml)進行干預(yù)處理,然后分別采用實時熒光定量PCR和免疫蛋白印跡(western blotting,WB)檢測EMT相關(guān)基因(E-cadherin、α-SMA、ColⅢ和Fibronectin)的mRNA和蛋白的表達水平,根據(jù)實時熒光定量PCR和WB結(jié)果分析苦參堿對人腹膜間皮細胞EMT是否存在抑制作用。
如果苦參堿對TGF-β1誘導人腹膜間皮細胞EMT存在顯著的抑制作用,則選取苦參堿抑制人腹膜間皮細胞EMT的最適濃度,然后再使用5ng/ml的TGF-β1誘導人腹膜間皮細胞使其發(fā)生EMT,同時采用最適濃度的苦參堿干預(yù)處理人腹膜間皮細胞,收集細胞提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進行RNA-seq測序分析其全基因組的mRNA的表達水平并篩選表達差異顯著的基因,再利用這些基因進行KEGG Pathway分析其主要富集的信號通路,初步探索苦參堿抑制人腹膜間皮細胞EMT的具體分子機制,最后通過實時熒光定量PCR和WB進行驗證。
結(jié)果：(1)5ng/ml的TGF-β1刺激能上調(diào)人腹膜間皮細胞α-SMA、ColⅢ和Fibronectin的mRNA和蛋白表達水平,下調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平;不同濃度的苦參堿(0.4、0.6、0.8和1.0mg/ml)干預(yù)處理后均能下調(diào)α-SMA、ColⅢ和Fibronectin的mRNA和蛋白表達水平,上調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平,其中0.8和1.0 mg/ml的苦參堿的干預(yù)效果最為顯著。
(2)RNA-seq測序的結(jié)果顯示,以q Value<0.05且差異倍數(shù)|Fold Change|>2為篩選條件,韋恩圖取各處理組表達差異顯著的基因之間的交集,篩選獲得154個表達差異顯著的基因與苦參堿抑制TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞EMT相關(guān);進一步通過KEGG通路分析這154個基因發(fā)現(xiàn)其主要富集在MAPK等信號通路上;另外,在這154個表達差異顯著的基因中發(fā)現(xiàn)TGF-β1激活的Smad依賴和非Smad依賴信號通路的共同下游因子Snail2表達差異顯著。
(3)WB檢測MAPK信號通路中的關(guān)鍵蛋白ERK1/2的磷酸化水平,結(jié)果顯示TGF-β1能顯著上調(diào)ERK1/2磷酸化蛋白的表達水平,而苦參堿干預(yù)處理后能使其水平下調(diào)。結(jié)論:苦參堿通過ERK1/2 MAPK信號通路下調(diào)Snail2基因的表達水平來抑制TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞EMT。
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