一、背景
小鼠樹突狀細(xì)胞是一類梭形,胞突呈分枝狀，常有大小粗細(xì)不等的胞突的貼壁細(xì)胞。DCS小鼠樹突狀細(xì)胞肉瘤是LⅡ瘤株在615小鼠皮下移植后，取脾臟原代培養(yǎng)，傳20代后形成的癌變細(xì)胞：細(xì)胞呈多角形、梭形及不規(guī)則形，胞突呈分枝狀，常有大小粗細(xì)不等的胞突；經(jīng)鑒定證明是小鼠樹突狀肉瘤細(xì)胞；在615小鼠皮下移植后成瘤。
二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備培養(yǎng)基；北美胎牛血清，10%；雙抗1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
2、細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
1.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
2.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
3.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
三、應(yīng)用
用于鼠李糖乳桿菌對(duì)豬輪狀病毒感染BALB/c小鼠樹突狀細(xì)胞分化與發(fā)育的影響研究：
將108只3-4周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組,分別為:LGG+PRV組、PBS+PRV組和PBS對(duì)照組:LGG+PRV組攻毒前7天每隔一天口服鼠李糖乳桿菌一次,濃度為100μL（106cfu）/只,第八天口服豬輪狀病毒,濃度為200μL/只;PBS+PRV組攻毒前七天口服同計(jì)量的磷酸鹽緩沖液（PBS）,第八天口服豬輪狀病毒,濃度為200μL/只;PBS組免疫攻毒期都口服PBS。
觀察小鼠體重變化狀況,于24h,48h,72h,96h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行如下指標(biāo)的檢測(cè)：（1）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)小鼠MLN、脾臟中CD11c+CD11b-CD8α+、CD11c+CD11b+CD8α-、CD11c+B220+CD8α+、CD11c+B220+CD8α-DC亞群分化情況和MHC-Ⅱ,CD80、CD86、CD40共刺激因子的表達(dá)水平；
（2）QRT-PCR檢測(cè)小鼠MLN與小腸中TLR3、NF-kappaB、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12以及IFN-γ的mRNA水平；
（3）ELISA法檢測(cè)IL-10和IFN-γ的含量變化。
結(jié)果表明：（1）PRV感染后LGG+PRV組與PBS+PRV組DCs亞群分化不同,LGG+PRV組主要向CD11c+CD11b-CD8α+、CD11c+B220+CD8α+DC亞群分化（P<0.05）,PBS+PRV組主要向CD11c+CD11b+CD8α-、CD11c+B220+CD8α-DC亞群分化（P<0.05）。說明鼠李糖乳桿菌免疫后促進(jìn)機(jī)體CD8α+DCs的分化,進(jìn)而高效的提呈抗原,并活化初始T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答,激活適應(yīng)性免疫。并且LGG+PRV組DCs高表達(dá)MHC-Ⅱ和CD80、CD86、CD40,由其48h時(shí)MHC-Ⅱ+DCs的極顯著表達(dá)（P<0.01）說明LGG免疫后促進(jìn)淋巴器官中DCs成熟,誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)行免疫識(shí)別促進(jìn)T細(xì)胞免疫反應(yīng),激活適應(yīng)性免疫。
（2）QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示LGG+PRV組增加TLR3、NF-κB、IL-12、IL-10、IL-6、TNF-α、IFN-γmRNA的表達(dá),48h-72h時(shí)TLR3、NF-κB、IL-12、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達(dá)水平差異顯著（P<0.05）。PBS+PRV組也呈增加趨勢(shì),其中IL-10、IL-6表達(dá)量顯著（P<0.05）,但I(xiàn)FN-γ的mRNA表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)。說明LGG免疫后感染病毒時(shí)促進(jìn)機(jī)體分泌TLR3、NF-κB和其他細(xì)胞因子,尤其是炎性細(xì)胞因子,從而激活TLR3與NF-κB通路增強(qiáng)機(jī)體固有免疫反應(yīng),介導(dǎo)適應(yīng)性免疫發(fā)生白細(xì)胞混合反應(yīng),并發(fā)生Th1/Th2偏振反應(yīng),避免對(duì)機(jī)體的不利損傷。
（3）ELISA檢測(cè)IL-10、IFN-γ的表達(dá)水平進(jìn)一步說明LGG抗PRV感染時(shí)主要調(diào)節(jié)Th1型及炎性細(xì)胞因子的分泌,促進(jìn)免疫應(yīng)答以抑制和緩解病毒感染。以上研究結(jié)果表明LGG促進(jìn)DCs分化與成熟,同時(shí)分泌TLR3、NF-κB及多種細(xì)胞因子,促進(jìn)固有免疫和適應(yīng)性免疫兩方面的免疫應(yīng)答,從而抑制和緩解病毒感染。
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