一、背景
小鼠胚胎瘤細(xì)胞是來源于畸胎瘤細(xì)胞的小鼠軟骨發(fā)生細(xì)胞系，在胰島素刺激下，分化成軟骨細(xì)胞，形成軟骨小結(jié)，表達(dá)Ⅱ型膠原和X型膠原最后發(fā)生礦化，反映軟骨發(fā)生過程。
二、細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟
1、小鼠胚胎瘤細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備：DMEM（推薦iCell-0001）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）小鼠胚胎瘤細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。換液頻率：每周2-3次
3）小鼠胚胎瘤細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。
2、小鼠胚胎瘤細(xì)胞處理：
1）凍存小鼠胚胎瘤細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。
2）小鼠胚胎瘤細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于小鼠胚胎瘤細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）小鼠胚胎瘤細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
下面T25瓶為例；
1、小鼠胚胎瘤細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。
三、應(yīng)用
小鼠胚胎瘤細(xì)胞可以用于共培養(yǎng)體系中不同代數(shù)的軟骨細(xì)胞對(duì)ATDC5細(xì)胞軟骨分化影響的實(shí)驗(yàn)研究：
基于三維共培養(yǎng)體系,將不同代數(shù)的豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(ACs)轉(zhuǎn)染后與小鼠胚胎瘤細(xì)胞(ATDC5)包裹在水凝膠中以建立可有效釋放生長(zhǎng)因子的共培養(yǎng)體系,探索不同代數(shù)軟骨細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子釋放的影響規(guī)律及共培養(yǎng)體系中ATDC5細(xì)胞的成軟骨分化效果的影響。
方法：
1、小鼠胚胎瘤細(xì)胞與豬軟骨細(xì)胞的獲取及、培養(yǎng)及傳代小鼠胚胎瘤細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)圣地亞哥的百奇生物公司,置于含有ATDC5培養(yǎng)液的150cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。采用酶解法從新鮮豬關(guān)節(jié)的軟骨組織中獲取豬軟骨細(xì)胞,置于軟骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)至第一代(P1)、第三代(P3)、第五代(P5)以供實(shí)驗(yàn)使用。
2、觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及檢測(cè)軟骨相關(guān)基因的表達(dá)情況在軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)過程中,應(yīng)用倒置顯微鏡觀察不同代數(shù)軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR)檢測(cè)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白(ColⅡ)、Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)和聚集蛋白聚糖(ACAN)基因的表達(dá)水平。
3、腺病毒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞及構(gòu)建水凝膠三維共培養(yǎng)體系用攜帶轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGF-β3)基因的重組腺病毒分別轉(zhuǎn)染P1、P3、P5軟骨細(xì)胞,并在轉(zhuǎn)染后第二天利用熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效果。隨后分別取一定數(shù)量已轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞并與提前培養(yǎng)好的ATDC5細(xì)胞按照1:3的比例混合,離心棄上清后用海藻酸鈉溶液重懸細(xì)胞混合物,在CaCl2溶液交聯(lián)作用下將海藻酸鈉/細(xì)胞混合液制作成凝膠微球,最后轉(zhuǎn)移至含有軟骨誘導(dǎo)液的24孔板進(jìn)行28天的培養(yǎng),并將這三組實(shí)驗(yàn)組分別命名為P1、P3、P5組。
4、檢測(cè)TGF-β3的釋放情況及評(píng)估體外軟骨分化效果。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)收集共培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液,利用Elisa檢測(cè)培養(yǎng)液中TGF-β3的濃度,并評(píng)估不同實(shí)驗(yàn)組之間TGF-β3的控釋效果。在水凝膠中成軟骨誘導(dǎo)過程的第28天,收集實(shí)驗(yàn)樣本,并利用q-PCR評(píng)估相關(guān)成軟骨特異性基因的表達(dá),同時(shí)應(yīng)用hematoxylin-eosin(HE)染色及免疫組化觀察軟骨標(biāo)志蛋白的分泌情況;根據(jù)獲得的數(shù)據(jù),評(píng)估體外成軟骨效果。
結(jié)果：
1、本實(shí)驗(yàn)提取的新鮮原代軟骨細(xì)胞在體外單層培養(yǎng)達(dá)到80%融合后傳代至P1、P3、P5后使用。在此過程中,原代軟骨細(xì)胞呈多角度形,傳代之后的軟骨細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)由多角形向梭形或類橢圓形變化;q-PCR檢測(cè)軟骨相關(guān)標(biāo)志基因的結(jié)果顯示,P1中的ACAN與ColⅡ基因表達(dá)相對(duì)較高,隨著代數(shù)的增加,ACAN與ColⅡ基因表達(dá)下降,同時(shí)伴隨著ColⅠ基因的表達(dá)上調(diào),說明軟骨細(xì)胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。
2、將攜帶TGF-β3基因的腺病毒感染P1、P3、P5軟骨細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后第二天,利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,可觀察到三組細(xì)胞均有明顯的熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到95%,其中P5組熒光強(qiáng)度最高,同時(shí)能觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。
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