一、背景
大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞（INS-1細(xì)胞）源自X射線照射的移植胰島瘤的大鼠，胰島素陽(yáng)性，可合成胰島素原I和II，可用于beta細(xì)胞功能研究。INS-1(大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞)“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞培增3～6次。細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過三個(gè)階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)／100個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細(xì)胞可達(dá)3～5％。接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力zui好時(shí)期，稱指數(shù)增生期(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)。
二、細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟
1、大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；0.05mMβ－巰基乙醇；丙酮酸鈉1%；雙抗，1%。
2）大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞處理：
1）凍存大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞的復(fù)蘇：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。
2）大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存：收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
三、應(yīng)用
大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞可以用于金絲桃素光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)誘導(dǎo)RINm5F胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究：
將市售貫葉連翹提取物3kg經(jīng)硅膠柱層析預(yù)處理,得到4.5g金絲桃素半成品,再用高速逆流色譜法進(jìn)一步純化精制,以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3-5-3-5)為溶劑系統(tǒng),下相為流動(dòng)相,上相為固定相,主機(jī)轉(zhuǎn)速800 r/min,流動(dòng)相流速為2.5 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)590 nm,每次進(jìn)樣量40 mg,共用12次完成了金絲桃素的大量制備,最終制得2g金絲桃素單體,經(jīng)液相檢測(cè)其純度大于98%,應(yīng)用1H-NMR和13C-NMR進(jìn)行鑒定,證明確為金絲桃素。
胰島細(xì)胞瘤會(huì)引發(fā)神經(jīng)低血糖癥狀和永久性神經(jīng)損傷,甚至?xí)?dǎo)致病人死亡。目前臨床上使用的治療方法,對(duì)于惡性胰島細(xì)胞瘤和良性胰島細(xì)胞瘤都沒有令人滿意的治療效果。金絲桃素作為光動(dòng)力學(xué)療法藥物對(duì)一些惡性腫瘤進(jìn)行治療時(shí),顯示出了良好的治療效果和極低的副作用,這促使我們研究利用光激活的金絲桃素抑制RINm5F胰島瘤細(xì)胞增殖的可行性,并探討其作用的基本機(jī)制。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用金絲桃素孵育RINm5F細(xì)胞,在加藥20分鐘后,細(xì)胞內(nèi)即可檢測(cè)到金絲桃素,在加藥60分鐘后,金絲桃素在細(xì)胞內(nèi)的積累達(dá)到最大峰值。金絲桃素在細(xì)胞內(nèi)的定位與質(zhì)膜結(jié)構(gòu)密切相關(guān),其定位在細(xì)胞的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi),尤其顯著地積累在細(xì)胞質(zhì)中。利用熒光標(biāo)記和激光共聚焦技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)金絲桃素能夠定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及線粒體等細(xì)胞器上。對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的金絲桃素進(jìn)行光激活,細(xì)胞的形態(tài)會(huì)發(fā)生改變。光激活的金絲桃素能夠通過抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的方式降低RINm5F細(xì)胞的活力。
金絲桃素抑制細(xì)胞增殖的作用主要體現(xiàn)在降低細(xì)胞中增殖蛋白Ki67的表達(dá),以及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期停滯。而且,金絲桃素的抗增殖作用是通過下調(diào)MAPK信號(hào)通路中JNK和ERK的磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的。光激活的金絲桃素還可以激活細(xì)胞內(nèi)的caspase-9和caspase-3,改變bax和bcl-2的表達(dá)比率,誘導(dǎo)RINm5F發(fā)生細(xì)胞凋亡。
此外,我們用IlluminaNextseq 500對(duì)金絲桃素處理過的細(xì)胞進(jìn)行了RNA-Seq測(cè)序分析,測(cè)序數(shù)據(jù)與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,從基因表達(dá)的水平上證明了金絲桃素影響細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。綜上所述,本文的研究結(jié)果為實(shí)現(xiàn)以金絲桃素作為光動(dòng)力學(xué)藥物應(yīng)用于胰島細(xì)胞瘤的治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
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