一、背景
人BURKKIT淋巴瘤細胞是從一位16歲黑人男性Burkitt's淋巴瘤患者建立了Daudi細胞株。表面免疫球蛋白陽性(sIg+)。Β2-微球蛋白陰性，EBNA陽性，并有衣殼抗原VCA。細胞株攜帶EB病毒。Daudi是典型的B淋巴母細胞，廣泛應(yīng)用于白血病發(fā)生機理的研究。
二、人BURKKIT淋巴瘤細胞培養(yǎng)方法
1、人BURKKIT淋巴瘤細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察人BURKKIT淋巴瘤細胞，若大部分細胞回縮且有少量人BURKKIT淋巴瘤細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將人BURKKIT淋巴瘤細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮人BURKKIT淋巴瘤細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、人BURKKIT淋巴瘤細胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將人BURKKIT淋巴瘤細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。
3、人BURKKIT淋巴瘤細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分人BURKKIT淋巴瘤細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；
③將人BURKKIT淋巴瘤細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。
三、應(yīng)用
人BURKKIT淋巴瘤細胞可以用于HBV抗原HBx對彌漫性大B細胞淋巴瘤作用機制研究：
CXCR4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)是一種趨化因子受體,與其配體SDF-1結(jié)合,對淋巴細胞有很強的趨化作用。CXCR4可以介導(dǎo)漿細胞等淋巴細胞“歸巢”到骨髓,而完成自我更新,并維持骨髓內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。CXCR4也可允許淋巴細胞在組織及淋巴管中的運行。而這種允許功能,可使淋巴瘤在診斷時即存在遠處轉(zhuǎn)移或骨髓受累,而這種現(xiàn)象在DLBCL中也可被觀察到。有研究表明CXCR4表達陽性是DLBCL的不良預(yù)后因素。因此,DLBCL合并HBV感染時,腫瘤細胞中是否存在CXCR4表達水平的改變,以及CXCR4是否可通過某種途徑參與腫瘤的預(yù)后不良,是本課題要解決的問題。
研究方法：收集2012年至2019年,來自5個醫(yī)療中心組織(吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林大學(xué)中日友好醫(yī)院,大連市第二醫(yī)院,山西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林省人民醫(yī)院)初次病理明確診斷為DLBCL的患者的樣本及臨床信息,其中96例HBsAg+DLBCL,10例HBsAg-DLBCL。10例HBsAg陽性HBV感染患者的肝組織作為陽性對照,10例無HBV感染淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的淋巴結(jié)組織作為陰性對照。通過IHC染色及改良IRS評分系統(tǒng),明確血清HBsAg陽性DLBCL患者組織中是否可檢測出HBV抗原(Pre-S1,Pre-S2,HBx,HBc)。
隨后應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染方法,建立HBx穩(wěn)定表達的DLBCL細胞系,通過流式細胞術(shù),qRT-PCR,PCR驗證目標基因的插入。通過CCK8,Annexin-V/7AAD,Transwell小室檢測細胞體外增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移功能。同時建立異種腫瘤小鼠模型、PET/CT等方法,在體內(nèi)觀察體腫瘤的增殖,同時應(yīng)用IHC,骨髓涂片,及骨髓累及情況查看疾病進展。
最后,通過Western Blot,測定HBx穩(wěn)定表達的SUDHL-4細胞CXCR4水平,及其下游的MEK/ERK、PI3K/AKT通路的磷酸化。明確CXCR4的作用通路,小干擾RNA實驗進一步驗證通路。完成HBx促進SUDHL-4細胞遷移機制的初步探索。
實驗結(jié)果：
1、HBsAg+DLBCL組織中,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法可檢測到HBx及Pre-S2抗原表達。其中HBx表達與HBV陽性DLBCL的HBV高載量、Ann Arbor分期Ⅳ期、不良預(yù)后以及c-Myc高表達有關(guān)。而Pre-S2的表達在臨床統(tǒng)計中未見顯著性差異。
2、體外實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達HBx的可以促使SUDHL-4和U2932細胞系增殖、遷移,抑制凋亡,但不能影響細胞侵襲。體內(nèi)實驗也表明HBx表達增加可促進腫瘤增長,骨髓累及明顯增多。
3、體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)在HBx穩(wěn)定表達SUDHL-4組,CXCR4表達升高,并在體外發(fā)現(xiàn)CXCR4下游MEK/ERK通路被磷酸化激活。小干擾RNA敲低CXCR4時上述磷酸化現(xiàn)象消失,同時抑制細胞遷移,證明在HBx穩(wěn)定表達的SUDHL-4,CXCR4可能是通過激活MEK/ERK通路影響細胞的生物學(xué)活性。
結(jié)論：
1、HBsAg+DLBCL患者腫瘤細胞中存在HBV抗原HBx及Pre-S2。
2、HBx表達的HBsAg+DLBCL患者臨床預(yù)后差。
3、HBx可能是通過上調(diào)CXCR4并激活CXCR4/MEK/ERK磷酸化途徑促進腫瘤遷移。
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