一、細胞簡介
平臺編號：Bio-73414
規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細胞信息：Super Tube
細胞名稱：Super Tube（狗腎細胞）
種屬：狗
年齡（性別）：雌；成年
組織來源：正常腎
生長特性：貼壁
細胞形態(tài)：上皮細胞樣
背景描述：從表觀正常的成年雌性可卡犬中建立了細胞株MDCK，從中克隆建立了狗上皮樣細胞株Super Tube細胞。當維持高細胞濃度時，Super Tube細胞形成大量的小管(據(jù)報道，24孔板的每孔鋪7×10^5細胞，3天內(nèi)就能形成小管)。要形成小管，Super Tube細胞需要每天兩次換液以提供足夠養(yǎng)分。與原始細胞株相比，Super Tube細胞的c-AMP的檢測水平低得多，在毛喉素刺激下讀出的腺苷環(huán)化酶水平也低；Super Tube細胞的跨上皮抗性也比Super Dome和MDCK都低。
生長培養(yǎng)基：DMEM高糖＋0.05mM NEAA＋10% FBS＋1% P/S
培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5% 溫度：37℃
用途：研究
注意事項：僅用于科學研究或者工業(yè)應用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準）
二、細胞用途
狗腎細胞是從一只外觀正常的成年雌性英國小獵犬的腎分離等到MDCK細胞株。角蛋白免疫過氧化物酶染色呈陽性。MDCK被用于研究β-粥樣蛋白前體的處理及其蛋白水解產(chǎn)物。
三、操作說明
1)對于常溫運輸?shù)募毎盏郊毎?，檢查是否有運輸問題，即細胞培養(yǎng)瓶或管是否破損，細胞培養(yǎng)液是否溢出。若沒有運輸問題，請75%酒精消毒后，保留封口膜，放入細胞培養(yǎng)箱中靜置。嚴格檢查培養(yǎng)箱的參數(shù)：溫度，濕度和CO2濃度。細胞靜置時間一般為6-12小時后，細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，即可開始后續(xù)操作。選用正確的細胞培養(yǎng)體系，A2780(人卵巢癌細胞)嚴格按照說明書的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。條件允許，培養(yǎng)的前三天內(nèi)做細胞拍照記錄，通過郵件發(fā)送給我們做及時狀態(tài)跟蹤。
2)對于干冰運輸?shù)募毎埲〕隼鋬龉芎?，須立即放?7C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。然后將其復蘇培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液。
四、應用
用于犬細小病毒YBYJ株全基因組克隆及其誘導MDCK細胞凋亡的初步研究：
首先根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的CPV序列設計7對引物,對CPV YBYJ株全基因組分段擴增,克隆和測序,用DNAstar對測序結果拼接,其全基因組包含5 051個核苷酸。
與GeneBank中發(fā)表的其它犬細小病毒毒株進行分子遺傳進化學分析,結果表明,CPV YBYJ株與亞洲地區(qū)的毒株的親緣關系最近,YBYJ株與CPV,SICHUAN（MH476590）的同源性最高,為99%。與GeneBank中發(fā)表的其它細小病毒毒株進行分子遺傳進化學分析,結果表明,CPVYBYJ株與貓細小病毒（FPV）的親緣關系最近,基因組同源性是98.6%,與馬細小病毒（EqPV）的親緣關系最遠,基因組同源性僅為35.1%。
本試驗應用CPV YBYJ強毒株在體外感染MDCK宿主細胞,通過光學顯微鏡和熒光倒置顯微鏡觀察到MDCK細胞被CPV感染后出現(xiàn)變圓、壞死和脫落等典型的細胞病變效應（CPE）。隨著CPV感染時間延長,細胞活性逐漸降低,具有一定的時間依賴性。
本試驗成功建立CPV感染MDCK宿主細胞模型。通過細胞凋亡一DNA Ladder抽提試劑盒抽提CPV感染MDCK細胞的總DNA。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示明顯的DNA Ladder。熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察Annexin V-FITC/PI雙染法染色的樣品,CPV感染48 h時,檢測孔內(nèi)有較多細胞呈現(xiàn)明亮的蘋果綠色,部分細胞呈現(xiàn)綠色胞膜包裹著紅色的胞核。
分別提取CPV誘導12 h,24 h,36h,48h和60h時MDCK細胞的蛋白,使用酶標儀確定Caspase-3相對活性,Caspase-3活性隨著時間延長先升高后降低,并在48 h時達到峰值（p<0.01）。但隨著時間繼續(xù)延長,凋亡作用活性檢測指標逐漸減弱。試驗結果說明,CPV YBYJ強毒株在體外可以誘導MDCK宿主細胞發(fā)生凋亡,誘導作用在感染48 h時最明顯,之后隨著誘導時間延長,細胞趨于晚期凋亡并且壞死。
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