一、小鼠胚胎成纖維細胞簡介
小鼠胚胎成纖維細胞作為原代培養(yǎng)細胞，其刺激增殖的能力強且可靠、易培養(yǎng)、來源豐富，常被用作干細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。一方面提供刺激干細胞增殖的各種因子，另一方面保持干細胞的未分化狀態(tài)。雖然MEF傳代次數(shù)有限，但可早期凍存一些，不斷復蘇，保持長期使用。MEF的缺點是無法耐受G418的篩選。替代方法是從持續(xù)表達抗性的小鼠品系或轉(zhuǎn)基因品系來分離培養(yǎng)MEF。利用各種轉(zhuǎn)基因鼠培養(yǎng)的MEF細胞還是各種基因功能研究的良好工具。
二、小鼠胚胎成纖維細胞培養(yǎng)方法
（一）材料
12.5~14.5d的小鼠胚胎(3~6只小鼠／次），培養(yǎng)皿（直徑10cm),DMEM+10%新生牛血清，15cm或50cm離心管（圓底），PBS配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手術(shù)刀、鑷子、剪子等器械。
（二）操作步驟
1、一般操作
(1)在培養(yǎng)皿中，解剖出鼠胚，以Hanks溶液消洗。
(2)除掉四肢、大腦及內(nèi)臟（肝臟）。
(3)用無菌Hanks溶液＋PBS漂洗3次。
(4)置培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪切碎。
(5)將剪碎組織移入50ml離心管中，加入約10ml消化液。
(6)37°C搖育10min（置水浴或孵育箱中）。
(7)吸5ml上清液放入另一50ml離心管中，加等體積含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和胰蛋白酶。
(8)再加入4ml消化液至原離心管（內(nèi)含組織），顛倒搖動，10min后再吸出5ml上清液到另一離心管中，加入5ml含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
(9)重復上一步驟5次左右，此時離心管中僅剩無法消化的軟骨等。
(10)離心50ml離心管，加50ml含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
(11)取適量移到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
(12)第二天換液，直到細胞長滿（匯合），1:10傳代，再生長至合適密度時可進行凍存。
(13)根據(jù)實驗需要復蘇細胞，由于MEF細胞傳代數(shù)有限，實驗時應(yīng)盡可能保留相同代數(shù)的細胞進行平行實驗。
2、絲裂霉素處理或γ-射線處理用作飼養(yǎng)層的MEF細胞還須進行絲裂霉素處理或干射線處理，步驟如下。
（1）絲裂霉素處理
復蘇凍存的MEF細胞(5×104個/cm2，保證用時滿滿一層，不留空間。
匯合狀態(tài)下的MEF加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml絲裂霉紊的DMEM培養(yǎng)液，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3h。
以PBS徹底漂洗數(shù)次，胰蛋白酶消化，以每分鐘1000轉(zhuǎn)的速率離心5min,收集沉淀，用新培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整濃度為3×105g個/ml。
將細胞接種于經(jīng)明膠預處理的培養(yǎng)皿中。（明膠預處理：0.1％明膠溶液浸泡2h,移走多余的明膠，待自然干燥。）
(2)γ-射線處理
匯合狀態(tài)的MEF細胞，以30~100Gy的γ－射線處理。
胰蛋白酶消化，收集細胞，離心（每分鐘1000轉(zhuǎn)，10min)、計數(shù)，接種到明膠預處理的培養(yǎng)皿中。Y-射線處理過的細胞也可以5×106個／ml的濃度凍存起來。復蘇后，1支凍存管可接種到4~5塊直徑6cm的培養(yǎng)皿中。
三、小鼠胚胎成纖維細胞培養(yǎng)操作
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為類；
1、細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
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