一、背景
人微血管內(nèi)皮細胞株是從人包皮中分離的微血管內(nèi)皮細胞用pSVT載體轉(zhuǎn)染，PSvt載體是一種基于pBR-322的質(zhì)粒，含有猿猴病毒40A基因產(chǎn)物大T抗原的編碼區(qū)。CRL-3243，HMEC-1，已被很好地表征，并顯示保留了內(nèi)皮細胞的許多特征。這些永生化細胞，因為它們是人類微血管內(nèi)皮細胞的持續(xù)可再生來源，可以在許多研究中用作原代人皮膚內(nèi)皮細胞的替代物。
二、人微血管內(nèi)皮細胞株細胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程參考
1、人微血管內(nèi)皮細胞株細胞復(fù)蘇
1）配制完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）細胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺中，化凍的細胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到細胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察細胞貼壁情況（未貼壁的即為死細胞--針對貼壁細胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、人微血管內(nèi)皮細胞株細胞傳代
1）待細胞生長到80%-90%匯合度時，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無菌PBS潤洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細胞消化時間不同），取出細胞，鏡下觀察細胞至細胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使細胞脫落下來成單個細胞懸液，收集細胞于15ml無菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集細胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細胞生長速度調(diào)整比例），分別加入到2個新的培養(yǎng)瓶中，做好標記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、人微血管內(nèi)皮細胞株細胞凍存
1）按照細胞傳代方法，在超凈工作臺內(nèi)消化收集細胞沉淀，取少量細胞用于計數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無血清細胞凍存液重懸細胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過夜后，轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
三、應(yīng)用
人微血管內(nèi)皮細胞株可以用于促甲狀腺激素抑制人微血管內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶的機制研究：
通過檢測TSH干預(yù)人微血管內(nèi)皮細胞(human microvascular endothelial cells,HMEC-1)后細胞內(nèi)eNOS及P-AKT、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphor-extracellular signal regulated kinase,P-ERK)含量的變化,探討TSH對eNOS的調(diào)控作用及其主要信號通路,深入了解TSH對血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)機制。
方法：體外培養(yǎng)HMEC-1細胞,提取細胞總RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法檢測HMEC-1促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)mRNA的表達,驗證HMEC-1細胞表達TSHR;分別以不同濃度TSH(0,10,100mIU/ml)干預(yù)HMEC-1 24h,應(yīng)用熒光定量PCR法檢測e NOS mRNA的表達水平,應(yīng)用Western blot法檢測eNOS的蛋白表達水平,觀察TSH對內(nèi)皮細胞eNOS的調(diào)節(jié)作用。
分別以不同濃度TSH(0,10,100mIU/ml)干預(yù)HMEC-1 24h,提取細胞總蛋白,應(yīng)用Western Blot法檢測總AKT、總細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)及其磷酸化蛋白的水平。以磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抑制劑LY294002、ERK抑制劑PD98059預(yù)處理細胞,分別阻斷TSH誘導(dǎo)的AKT和ERK的活化,再加入100mIU/ml TSH干預(yù)細胞,培養(yǎng)24h后,提取各組細胞總蛋白,應(yīng)用Western Blot法檢測eNOS、P-AKT、AKT、P-ERK、ERK蛋白水平,探討TSH調(diào)節(jié)HMEC-1 eNOS的機制。
結(jié)果：
(1)HMEC-1細胞表達TSHR。
(2)以不同濃度的TSH干預(yù)HMEC-1,TSH呈劑量依賴性顯著抑制eNOS的表達,且TSH呈劑量依賴性顯著促進P-AKT、P-ERK的表達。
(3)應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002、ERK抑制劑PD98059預(yù)處理HMEC-1將AKT、ERK通路阻斷后TSH對HMEC-1 eNOS的抑制作用顯著減弱。結(jié)論:TSH可能通過PI3K/AKT、ERK信號通路抑制HMEC-1eNOS的表達。
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