一、背景
人永生化肝細(xì)胞取自男性供體，經(jīng)過SV40永生化處理，細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長。
二、人永生化肝細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇人永生化肝細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)人永生化肝細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)人永生化肝細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人永生化肝細(xì)胞可以用于凍存人源永生化肝細(xì)胞微囊用于生物人工肝治療的研究：
選擇功能最佳的人源性永生化肝細(xì)胞制作微囊,以大規(guī)模于液氮中凍存后,在新型生物人工肝支持系統(tǒng)中檢測肝衰竭病人血漿對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用以及肝細(xì)胞對(duì)肝衰竭病人血漿的清除效果,為生物型人工肝的臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
方法：
1、永生化人源肝細(xì)胞的功能評(píng)價(jià)。利用MTT、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光和Western blot及ELISA等檢測增殖及功能。
2、將反應(yīng)器流化培養(yǎng)的永生化肝細(xì)胞系微囊與靜態(tài)培養(yǎng)肝細(xì)胞系微囊、二維培養(yǎng)肝細(xì)胞作對(duì)比,比較細(xì)胞中與功能相關(guān)Ⅰ相酶、Ⅱ相酶和特異性核受體基因、CYP450蛋白表達(dá)的變化。檢測肝細(xì)胞生存率及白蛋白分泌和尿素合成確定凍存條件、凍存時(shí)間以及復(fù)蘇孵育條件并且評(píng)價(jià)微囊化肝細(xì)胞大規(guī)模凍存效果。
3、體外初步評(píng)價(jià)生物人工肝的有效性。收集肝衰竭病人血漿,將復(fù)蘇并孵育后的肝細(xì)胞微囊加入到肝衰竭病人血漿中培養(yǎng)24h,觀察肝衰竭病人血漿對(duì)微囊內(nèi)肝細(xì)胞活性和功能的影響以及肝衰竭病人血漿內(nèi)重要物質(zhì)成分的變化。
結(jié)果：
1、HepLi3細(xì)胞增殖能力最好,可以進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng),獲得高數(shù)量的細(xì)胞,而且其在功能上明顯優(yōu)于其他永生化肝細(xì)胞。
2、微囊化和流化培養(yǎng)的肝細(xì)胞在培養(yǎng)過程中保持很好的活性；微囊化的培養(yǎng)方式可以促進(jìn)肝細(xì)胞特異基因及蛋白的表達(dá)；此種培養(yǎng)方式可能是通過抑制細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶活性來提高肝細(xì)胞特異性功能的。
3、確定微囊制作完成孵育2h后進(jìn)行凍存操作；凍存復(fù)蘇后孵育2h,其功能可恢復(fù)很好,且將體積擴(kuò)大到50毫升不會(huì)影響肝細(xì)胞的凍存后的功能。
4、肝衰竭病人血漿造成肝細(xì)胞活率下降12%,但不影響其作為種子細(xì)胞的應(yīng)用。而且微囊化肝細(xì)胞系可以改變肝衰竭病人血漿中物質(zhì)成分,促進(jìn)其體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
結(jié)論：
1、本實(shí)驗(yàn)室制作的HepLi3可作為生物人工肝的種子細(xì)胞有效發(fā)揮肝特異性功能。
2、確定了微囊的制作,肝細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的條件,并探究蛋白激酶的抑制可能是微囊化促進(jìn)肝細(xì)胞功能的原因。
3、大規(guī)模凍存微囊化肝細(xì)胞后,細(xì)胞活性保持良好,可以為生物人工肝提供種子細(xì)胞庫。
4、利用肝衰竭病人血漿及生物反應(yīng)器證明凍存后的微囊化肝細(xì)胞可降低重肝血漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和直接膽紅素。
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