一、背景
小鼠乳腺癌細胞是從410.4瘤株中未經(jīng)誘變篩得的6-硫鳥嘌噙抗性細胞株。當注射到BALB/c小鼠中時，小鼠乳腺癌細胞自發(fā)產(chǎn)生高轉(zhuǎn)移腫瘤，可轉(zhuǎn)移到肺，肝，淋巴結(jié)和大腦，同時在注射部位形成始發(fā)灶。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移時不需要摘除始發(fā)灶。
小鼠乳腺癌細胞細胞在BALB/c小鼠中的生長與轉(zhuǎn)移特性與人體中的乳腺癌十分相近。這種腫瘤是人VI期乳腺癌的動物模型。小鼠乳腺癌細胞-誘導(dǎo)的腫瘤在手術(shù)后及未手術(shù)情況下轉(zhuǎn)移的動力學相近，可以用作手術(shù)后及未手術(shù)模型。跟其他腫瘤模型相比，由于小鼠乳腺癌細胞的抗6-硫鳥嘌噙特性，微小的轉(zhuǎn)移細胞團(少到僅僅1個)也可以在許多遠端器官中檢測到。
二、小鼠乳腺癌細胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇小鼠乳腺癌細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心3分鐘，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入
培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中），加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2)小鼠乳腺癌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3min（視細胞消化情況而定），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)小鼠乳腺癌細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
小鼠乳腺癌細胞可以用于CombretastatinA-4（CA4）抑制乳腺癌細胞增殖和遷移侵襲作用的研究：
從細胞生長、凋亡、細胞形態(tài)、遷移、侵襲、裸鼠成瘤等方面系統(tǒng)地探究CombretastatinA-4(CA4)對三陰性和Luminal型乳腺癌細胞的作用及其分子機制,以推動CA4的進一步應(yīng)用,為CA4作為治療乳腺癌的臨床藥物提供前期基礎(chǔ)。
方法：以兩種不同的乳腺癌細胞系:MDA-MB-231(ER-,PR-,HER2-三陰性)和MCF-7(PR+,ER+,HER2-Luminal型)為作用對象,評估CombretastatinA-4(CA4)對不同類型乳腺癌細胞的抗腫瘤作用。CCK-8法檢測CA4對MDA-MB-231和MCF-7細胞增殖的影響,流式細胞術(shù)分析不同濃度CA4刺激對MCF-7細胞周期和凋亡的影響。
免疫熒光染色觀察CA4刺激后細胞形態(tài)變化情況。Wound healing實驗和Transwell實驗評估CA4處理后乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的變化。RT-PCR和Western blotting檢測不同濃度CA4刺激乳腺癌細胞后EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和標志物表達水平的變化情況。此外,裸鼠成瘤實驗進一步探究CA4在體內(nèi)對乳腺腫瘤的作用效果。
結(jié)果：與Erianin相比,CombretastatinA-4(CA4)在較低劑量下抑制了MDA-MB-231(ER-,PR-,HER2-三陰性)和MCF-7(PR+,ER+,HER2-Luminal型)乳腺癌細胞的生長和增殖,并使MCF-7(PR+,ER+,HER2-Luminal型)乳腺癌細胞周期被阻滯在G2期,而且CA4還誘導(dǎo)了MCF-7細胞凋亡。CA4改變了乳腺癌細胞偏間質(zhì)特征的形態(tài),使其更傾向于呈現(xiàn)上皮細胞表征。
重要的是,與Erianin相比,CA4對MDA-MB-231(ER-,PR-,HER2-三陰性)和MCF-7(PR+,ER+,HER2-Luminal型)細胞的遷移和侵襲顯示出相對更強的抑制作用。相應(yīng)地,CA4處理后,乳腺癌細胞中有利于EMT發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子或表明其發(fā)生的間質(zhì)標志物,如ZEB1、Snail家族和Vimentin、N-cadherin的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平下降,而E-cadherin等有利于細胞呈現(xiàn)上皮形態(tài)的標記物的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平升高。
值得注意的是,在不同類型乳腺癌細胞中,CA4處理后都觀察到Slug蛋白表達水平的明顯下降。此外,CA4能夠抑制MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞異種移植瘤模型小鼠體內(nèi)腫瘤的生長。
結(jié)論：CombretastatinA-4(CA4)通過使乳腺癌細胞發(fā)生周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡進而對乳腺癌細胞的生長和增殖產(chǎn)生抑制作用。最為重要的是,CA4顯著抑制三陰性(ER-,PR-,HER2-)和Luminal型(PR+,ER+,HER2-)乳腺癌細胞的遷移和侵襲,其作用機制是調(diào)控EMT的發(fā)生,Slug是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子。CombretastatinA-4(CA4)是一種潛在的應(yīng)用前景廣闊的抗腫瘤藥物。
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