一、背景
人咽鱗癌細(xì)胞是1968年從一位印度下咽骨腫瘤患者的鉆孔活組織切片中建立了FaDu細(xì)胞株。在建立的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中含有成束的細(xì)絲，并且細(xì)胞分界上的橋粒特別突出。
二、人咽鱗癌細(xì)胞操作流程
1、收到人咽鱗癌細(xì)胞后，請按照以下方法進行操作：
取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進行傳代。
2、人咽鱗癌細(xì)胞傳代：
1）人咽鱗癌細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml完全培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，最后放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待細(xì)胞完全貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。
3、人咽鱗癌細(xì)胞凍存：
1）人咽鱗癌細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9：1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。
4、人咽鱗癌細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
三、應(yīng)用
人咽鱗癌細(xì)胞可以用于外泌體運載的TRPP2 siRNA抑制咽鱗癌細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)變：
近年來放療、化療、免疫治療以及外科手術(shù)已廣泛應(yīng)用于頭頸癌的臨床治療中,但由于癌細(xì)胞容易轉(zhuǎn)移,頭頸部惡性腫瘤的治療效果仍不理想。其中,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的重要一環(huán)。TRPP2(瞬時電位通道)信號通路已經(jīng)被證明可以通過調(diào)節(jié)喉鱗狀細(xì)胞癌的EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變)過程來增強癌細(xì)胞的侵襲與遷移。這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤的臨床治療提供了新的思路。
探討外泌體/TRPP2 siRNA復(fù)合物是否可以通過抑制TRPP2表達來影響FaDu(人咽鱗癌細(xì)胞)細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程。
方法：
1、外泌體與TRPP2 siRNA結(jié)合使用外泌體提取液和高速離心的方法提取人胚腎293細(xì)胞(HEK-293)外泌體,用瓊脂凝膠電泳法檢測TRPP2 siRNA與外泌體是否穩(wěn)定結(jié)合。
2、觀察外泌體/TRPP2 siRNA復(fù)合物在FaDu細(xì)胞中的分布使用熒光顯微鏡觀察被熒光染料標(biāo)記的外泌體及TRPP2 siRNA,以確定外泌體/TRPP2 siRNA復(fù)合物是否被FaDu細(xì)胞攝取。
3、檢測TRPP2、vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白在被外泌體/TRPP2siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后的FaDu細(xì)胞中的表達使用Western blotting的方法檢測TRPP2,vimentin,N-cadherin和E-cadherin蛋白的表達水平,以確定轉(zhuǎn)染后的FaDu細(xì)胞的TPRR2通道及EMT過程是否受到影響。
結(jié)果：
1、外泌體能與TPRR2 siRNA穩(wěn)定結(jié)合。
2、外泌體/TRPP2 siRNA復(fù)合物能被FaDu細(xì)胞大量攝取。
3、外泌體/TRPP2 siRNA復(fù)合物能使轉(zhuǎn)染的FaDu細(xì)胞EMT過程減弱。結(jié)論外泌體/TRPP2 siRNA復(fù)合物可以被FaDu細(xì)胞攝取并顯著影響其TRPP2表達和EMT過程,外泌體/TRPP2 siRNA復(fù)合物有望成為頭頸腫瘤治療的新的方向。
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